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1.基于细菌纤维素的抗菌生物缝线的制备及性能研究
作者：刘秀童;姚春丽;陈阁谷
作者单位：北京林业大学
关键词：细菌纤维素;缝线;抗菌;生物相容性;季铵化改性
摘要: 细菌纤维素(BC)因其具有高结晶度、优异的亲水性和生物相容性,在生物医用领域如组织工 程、伤口敷料及药物递送等方面展现出潜在应用价值。针对纯BC缝线柔韧性差及缺乏抗菌性的问 题,以细菌纤维素凝胶膜为基底,利用2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(EPTMAC)对 BC进行阳离子季 铵化改性处理,此举不仅降低了纯 BC的结晶度,还赋予 BC缝线良好的抗菌性,制备出具有阳离子 性的 BC凝胶膜。通过预拉伸—加捻—干燥三步法制备柔韧抗菌的阳离子细菌纤维素(CBC)缝线。 研究结果表明,该缝线不仅力学性能得到显著提升(打结抗张强度为(21.5±1.1)N),还保持了良 好的生物相容性,细胞存活率高达92.0%,并展现出99.9%的高效抗金黄葡萄球菌能力。与石油 基缝合线相比,这种 BC基生物缝线成本更低,且性能优异,能有效减少缝合处的二次伤害风险,在 外科缝线领域具备巨大的应用前景和发展潜力。
缝合线作为外科手术不可或缺的重要材料,在 日益增长的医疗需求中发挥着至关重要的作用。受 交通事故频发、医美行业兴起及人口老龄化加剧等 多重因素的影响,缝合线的市场需求正以每年数百 万美元的速度增长[1]。为应对外科手术中多样化的 场景需求,市场上涌现出多种类型的手术缝合线,主 要分为天然和合成2大类[2]。其中,合成材料如聚 酯、聚丙烯等,凭借其高强度、优异的柔韧性和打结 安全性,在医用缝合材料中 占 据 重 要 地 位[3-4]。然 而,这些合成高分子材料终究被视为机体异物[5]。 在生物体内的降解过程中,这些材料会与周围组织 相互作 用,可 能 诱 发 组 织 炎 症 反 应 和 机 体 排 异 反 应[6]。这些不良反应不仅阻碍伤口的正常愈合过 程,还可能给患者带来额外的痛苦及并发症风险[7]。 因此,研发一种具有良好的生物相容性、抗菌性能及 缝合性能的生物缝合材料显得尤为迫切[8]。
近年来,研究人员正在寻找天然材料来开发具 有更高安全性和伤口愈合效果的新型缝合材料。天 然纤维素缝线,如棉、亚麻、羊肠线等,早在手术缝合 的初期就已经得到了广泛应用。除传统的天然纤维 素外,胶原蛋白、天然蛋白质纤维、植物纤维和壳聚 糖等材料也被广泛使用,这些材料具有天然的生物 相容性和生物可降解性,有助于促进伤口的愈合[7]。 研究表明,纤维素及其衍生物成为新型创新缝合材 料的理想候选材料。Guambo等[9]的研究表明,由 于优异的力学性能、快速降解和无细菌黏附,植物纤 维素纤维有可能用于外科缝合。植物不是唯一能产 生纤维素的生物,一些微生物,包括细菌、真菌和藻 类,也能合成纤维素。细菌纤 维 素(BC)是 通 过 细 菌发 酵 获 得 的,不 会 产 生 不 需 要 的 化 合 物[10-11]。 尽管与植物纤维素具有相同的化学结构,但 BC具 有高纯度、良 好 的 保 水 性、弹 性、高 强 度 和 成 型 性 等特征。高纯度、结晶度和含水量是 BC在生物学 中广泛潜在应用的原因[8]。此外,BC 还具有良好 的生物相容性,这使其在生物医学领域具有广阔的 应用前景[12]。为了充分发挥 BC的优势,通过化学 修饰、辐射和形态学可控性等方法对 BC进行精细 调控[12]。因此,BC成为众多生物医学领域的理想 候选 材 料,包 括 组 织 工 程、伤 口 敷 料、药 物 递 送等[10-11]。
纯细菌纤维素基缝合线虽已有研究,但仍存在 柔韧性差、无抗菌性的问题[13]。为解决该难题,科 研人员通过物理 浸 渍 BC 凝 胶 膜 对 其 进 行 物 理 改 性[14-15]。然而浸渍通常需要更多的时间来达到良好 的结合效率。化学改性是另一种具有高度可操作性 的 BC改性方法,通常通过氧化、醚化和接枝共聚等 化学反应引入新的功能基团[16-20],赋予其更多功能 性。纤维素的醚化反应,作为制备具有抗菌性能的 阳离子纤维素[21]的常用手段,以其操作简便、能耗 低、产物易得等优点受到青睐[22-23]。其中,季铵化试 剂 2,3-环氧丙基氯化铵作为一种常见的阳离子化改 性试剂,可通过醚化反应对 BC进行化学改性,引入 阳离子基团(CH3)3N + 赋予纤维素基材料良好的抗 菌性[24-26]。
为提高 BC 缝线的柔韧性以及抗菌性,本研究 在 NaOH/尿素水体系下,利用2,3-环氧丙基三甲基 氯化铵(EPTMAC)季铵化改性纯 BC 凝胶膜,降低 纯 BC结晶度的同时赋予其良好的抗菌性,通过预 拉伸—加捻—干燥三步法制备柔韧抗菌的阳离子细 菌纤维素(cationic bacterial cellulose,CBC)缝线,并 对其力学性能、生物相容性和抗菌性进行深入研究。 通过优化制备工艺和改性方法,制备出具有良好力 学性能、生物相容性和抗菌性能的阳离子细菌纤维 素缝线。
1 试验部分
1.1 试验材料与设备
EPTMAC(纯度≥95%,M W =151.63),上海蓝 翼化工有限公司;尿素(99%,M W =60.06),上海蓝 翼化工有限公司;乙酸(99%),上海蓝翼化工有限公 司;细 菌 纤 维 素 凝 胶 膜 (长 32cm、宽 23cm、厚 5mm,含水率98%),海南亿德食品有限公司;无水 乙醇,鑫润德化工有限公司;氢氧化钠,上海蓝翼化 工有限公司。
1.2 基于 BC的抗菌生物缝线的制备
利用季铵化试剂 EPTMAC 进行阳离子改性, 制备阳离子细菌 纤 维 素 膜:称 量 10 g细 菌 纤 维 素 凝胶 膜、11.5 g 尿 素 及 7.5 g 氢 氧 化 钠,注 入 81.5 mL去 离 子 水,充 分 搅 拌 后,将 混 合 液 置 于 -30 ℃的环境中冷冻30 min。随后,置于60 ℃的 水浴中加热,将预定量的 EPTMAC水溶液缓缓滴 入混合液,反应6 h后终止,最终生成黄色固态物 质。经过无水乙醇的洗涤处理,获得阳离子细菌纤 维素凝胶膜。
抗菌 细 菌 纤 维 素 缝 线 的 制 备:以 季 铵 化 改 性 BC为原料,经预拉伸—加捻—干燥制备阳离子细 菌纤维素 CBC缝线。将5 mm 厚的 BC膜切成长 32 cm,宽1 cm 的条状,预 拉 伸 30%,加 捻 圈 数 为 3 000 圈,在拉伸状态下烘干。CBC 缝线的制备工 艺如图1所示。
1.3 基于 BC的抗菌生物缝线的表征
1)CBC缝线的微观结构 采用扫描电子显微镜分别对 BC、CBC 凝胶膜 和 CBC缝线的表面形态进行观测。凝胶膜经冷冻 干燥后,在样品台并进行喷金处理。观测 CBC缝线 截面前需将样品用液氮进行脆断。
2)细菌纤维素缝线的取代度 阳离子纤维素的取代度指的是纤维素分子链上 羟基被阳离子基团取代的程度。采用元素分析仪 (美国 Thermo Scientific Flash 2000型),根据其氮 元素的含量计算得到取代度(D):
式中,wN 为 CBC缝线中氮元素的质量分数。
3)CBC缝线的化学结构
将 CBC凝胶膜充分干燥至恒重,采用压片法, 通过傅里叶红外吸收光谱仪对样品进行测试,测试 范围为400~4000 cm -1。
将 CBC凝胶膜切碎,用超声波细胞粉碎机超声 4 h,制成悬浮液,使用 ZEN 3600型 Zeta电位分析 仪测量Zeta电位。
将 CBC凝胶膜充分干燥至恒重,通过 X射线衍 射仪对样品进行测试,测试范围为5°~40°,扫描速 度为2(°)/min。
4)CBC缝线的力学性能
根据 YY 0167—2020《非吸收性外科缝线》,通 过测试抗 断 裂 张 力、断 裂 延 伸 率、打 结 抗 张 强 度, 详细评估 CBC 缝 线 的 力 学 性 能。具 体 测 试 方 法 如下:
断裂抗张强度和断裂伸长率:选取10根直径为 0.5~0.6 mm、长度为20 cm 的 CBC 缝线,利用电 子拉力试验机进行测试,速率为300 mm/min,标距 为130 cm。 打结抗张强度:打结抗张强度为致使打结缝线 断裂所需的拉力。选取10根直径为0.5~0.6 mm、 长度为20 cm 的 CBC缝线,在缝线中间点打一个简 单结,利用电子拉力试验机进行测试。测试过程中, 拉伸速率为300 mm/min,标距为130 cm。
摩擦性能:采用缝线摩擦性能测试仪测试缝线 间的动摩擦力以表征其摩擦性能[27]。
5)CBC缝线的细胞毒性
采用 MTT法测试 BC缝线对 HepG2细胞的细 胞毒性。按照血清为9∶1的比例配制培养基。HepG2 细胞在37 ℃、5% CO2 的恒温培养箱中培养。称取 0.5 g待测样本,121 ℃高温高压灭菌20 min,再加入 5 mL培养基,使用0.22 μm 滤膜过滤除菌即得到 100 mg/mL 的 样 本 母 液;取 500 μL 样 本 母 液 和 9.5 mL 培 养 基 制 成 5 mg/mL 样 本 溶 液。 将 HepG2细胞 接 种 到 96 孔 板 中,每 孔 加 入 100 μL 培养基,试验组加入质量浓度为5 mg/mL 的 BC, 在含5% CO2、恒温37 ℃的培养箱中,培养24 h及 48 h。移除培养基,用 PBS溶液清洗后,每孔加入 100 μL含0.5 mg/mL MTT 的 培 养 基,再 次 置 于 培养 箱 中,培 养 4 h。 弃 上 清,每 孔 加 入 100 μL DMSO 溶液,轻 轻 摇 晃 10 min,检 测 570 nm 处 吸 光度。相对增值率(R)的计算公式为:
细胞毒性分级标准: 0级:≥100%;1 级:80% ~99%;2 级:50% ~ 79%;3级:30%~49%;4级:0~29%。
Live/dead染色试验:BC与细胞共培养24 h后 移除培养基,用 PBS清洗各孔三次;加入染色液,室 温避光孵育15 min后观察拍照。活/死细胞染色试 剂盒可将活细胞染成绿色,死细胞染成红色。
6)CBC缝线的抗菌性
准备三支12 mL 细菌培养管,每管盛有3mL LB(Luria-Bertani)液体培养基,其中两支分别含有 金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌,第三支无菌落。将 这些 培 养 管 放 置 在 恒 温 振 荡 器 中,设 定 温 度 为 37 ℃、转速为200 r/min,进行振荡培养(15 h)。将 CBC置于一 次 性 培 养 皿 中,于 紫 外 灯 下 照 射 灭 菌 30 min,以确保其完全灭菌。将菌液稀释至合适倍 数,将灭菌后的 BC 放入培养基,37 ℃下振荡培养 24 h。培养完成后,10倍稀释,37 ℃恒温培养18 h, 拍照并记录菌落数。
2 结果与讨论
2.1 CBC缝线的形貌表征
纯 BC凝胶膜是一种具有三维网络结构的膜材 料(图2(a-b))。如图2(c)所示,季铵化改性制备的 CBC膜表面显示出平整光滑的表面。在图2(d-e) 中展示的 CBC样品的能量色散光谱显示 Cl和 N 元 素均匀分布,证明季铵盐阳离子((CH3)3N +Cl - )已 成功引入 CBC 膜。BC 凝胶 膜 的 纤 维 杂 乱 无 章 排 列,而制备的 CBC 缝线具有整齐紧密的螺旋结构。 通过扫描电镜观察 CBC 缝线的侧面 时,清 晰 可 见 其螺旋 状 结 构 (图 2(f-h)),结 构 内 部 孔 隙 消 失, 纤维被外部扭 曲 的 纤 维 所 挤 压。 从 截 面 看,CBC 缝线的层层螺旋结 构 清 晰 可 见,细 菌 纤 维 素 纳 米 纤维紧密而有序地 排 列 在 一 起,从 而 提 高 其 力 学 性能(图2(i-k))。
2.2 投料比对取代度的影响
表1展示了投料比与取代度之间的关系。随着 EPTMAC与 BC比值的增大,产物取代度增大。将 EPTMAC与 BC的质量比为1∶2、1∶1、2∶1、3∶1的CBC缝线分别命名为 CBC12、CBC11、CBC21、CBC31。 通过调整反应比例,可有效调控产物的取代程度。 随着 EPTMAC 添加量增多,羟基取代度由1.37% 上升为1.61%,N 含量由11.69%上升到13.71%。 随着 EPTMAC与 BC的投料比增加,取代度变化不 大。EPTMAC的比例增大时,可提供更多的反应基 团与 BC 上的羟基反应,进而使得更多的 EPTMAC 分子连接到BC分子上,羟基被取代的物质的量也随 之增加,进而取代度增大。当反应达到稳定状态时, 羟基被取代的量会减少,导致取代度的变化不大。
2.3 CBC缝线的化学结构表征
CBC 的红外 光 谱 如 图 3 所 示。3 336、2 905、 1 065 cm -1 分别为CBC的 O—H 伸缩振动吸收峰、 烷基中 C—H 键伸缩振动和弯曲振动吸收峰,糖苷 键中 C—O 伸缩振动吸收峰,BC的基本结构并未改 变[28]。1 065 cm -1 峰位增强,表明醚键(C—O—C) 生成。相比纯BC,CBC样品在1 667和1 422 cm -1 处出现新的吸收峰,其中1 667 cm -1 是 N—H 的弯 曲振动峰,而 1 422 cm -1 处为 CBC 中 C—N 键的伸缩振动。此外,3 336 cm -1 附 近 的 羟 基 峰 位 偏 移且变宽,该结果可 能 与 阳 离 子 集 团 具 有 更 强 的 氢键相互作 用 有 关;红 外 光 谱 表 明 BC 已 被 季 铵 化试剂 EPTMAC 成 功 改 性,接 枝 上 阳 离 子 基 团 (CH3)3N +Cl - 。
通过醚化反应将季铵基团引入细菌纤维素分子 骨架,从而改变其表面电荷性质,醚化机制如图4(a) 所示。与 纯 BC 的 分 子 结 构 相 比,阳 离 子 官 能 团 (CH3)3N +Cl - 通过醚化 反 应 接 枝 到 BC 分 子 链 骨 架结构中。Zeta电 位 测 试 结 果 如 图 4(b-c)所 示。 纯细菌纤 维 素 凝 胶 膜 含 大 量 羟 基 并 带 有 负 电 荷, Zeta电位 呈 负 数,为 -12.0 mV。季铵化改性后, BC电位由负变正,为+23.1 mV,证实阳离子基团 (CH3)3N +Cl - 成功接枝到细菌纤维素分子链中。
通过 XRD研究不同物料比例下 CBC样品的结 晶结构和结晶度,结果如图5所示。不同物料比例下 CBC的衍射峰中,2θ 为14°、16°、22.5°处的衍射峰对 应纤维素I型的[100]、[010]和[110]三个晶面。与纯 BC相比,季铵化改性 BC 的主要特征衍射峰不变。 CBC12、CBC11、CBC21、CBC31 的 结 晶 度 分 别 为 71.6%、69.4%、50.3%、45.6%。与 BC(80.8%)相 比,改性后的 CBC 结晶度显著下降。CBC 在2θ 为 22.5°处的衍射峰强度明显变弱,表明细菌纤维素分子 上部分羟基消失,破坏了部分结晶区,导致 CBC的结 晶度大幅降低[29]。从柔韧性来看,由于结晶度的降 低,CBC缝线比纯BC更柔软,有利于其实际应用。
2.4 CBC缝线的力学性能
力学性能如图6(a)所示。纯 BC缝线的断裂抗 张强度为53.1 MPa,改性后 CBC 的断裂抗张强度 显著提升。CBC12缝线的断裂抗张强度为94.7 MPa, 显示 出 较 强 的 抵 抗 外 力 拉 伸 的 能 力。 而 随 着 EPTMAC比例的增加,CBC11、CBC21和 CBC31的 断裂 抗 张 强 度 逐 渐 降 低,分 别 为 94.8、82.6 和 56.2 MPa。CBC 缝 线 的 断 裂 伸 长 率 变 化 不 大, CBC12、CBC11、CBC21、CBC31 的断裂伸长率分别 为7.6%、9.5%、6.4%和6.9%。
打结抗张强度数据(图6 (b))显示,与纯 BC打 结 强 度 (15.9 N)相 比,CBC12、CBC11、CBC21、 CBC31 打 结 抗 张 强 度 分 别 为 (20.2±1.1) N、 (21.5±1.1) N、(18.1±1.8) N、(14.9±1.2) N。 结果表明,随着季铵化改性程度的提高,CBC 力学 性能先提升后降低,当BC与EPTMACETA 的质量 比为1∶1时,CBC 缝线的打结抗张强度达到最佳状 态,可与聚酰胺缝线(20.5±0.8)N 媲美,达到行业 标准(17.2 N)。该结果是由于,正电基团的引入使 得纤维之间存在静电吸引及氢键的双重作用,从而 缝线强度得以大幅度提高。然而,过量季铵化试剂 破坏了细菌纤维素的结晶度,致使纤维内部结构均 一性遭到破坏,力学性能逐渐下降。因此,合适的取 代度及改性程度对 CBC 缝线的力学性能具有重要 意义。由表2可知,缝合线之间的摩擦力与投料比 关系不大。摩擦力与材料的表观接触面积、表面粗 糙度、表 面 硬 度 等 有 关。CBC12、CBC11、CBC21、 CBC31在制备工艺方面并无不同,加捻圈数一样, 所以摩擦力变化不大。
2.5 CBC缝线的生物特性
综上所述,投料比为1∶1的 CBC11缝线力学性 能最佳,因此采用投料比为1∶1的 CBC 缝线测试细 胞毒性和抗菌性。细胞活性结果如图7(a-b)所示。 在质量浓度1.25、2.50、5.00 mg/mL下与细胞共培 养24 h后,细胞活性分别为92.0%、89.5%、84.3%。
在质量浓度1.25、2.50、5.00 mg/mL下与细胞共培 养 48 h 后,细 胞 活 性 分 别 为 91.0%、82.5%、 76.3%。在0~5 mg/mL 的质量浓度范围内,CBC 对 HepG2细胞没有明显的细胞毒性,在高质量浓 度5 mg/mL下与细胞共培养24 h及48 h后,细胞 活性仍 超 过 80% 和 70%,结 果 表 明:CBC 缝 线 材 料不 具 备 明 显 细 胞 毒 性,与 HepG2 细 胞 相 容 性 较好。
图7 (c)为 HepG2细胞与 CBC 材料共培养一 天的 Live/dead细胞荧光染色图。如图所示,Calcein 染色后的细胞发出强烈的绿色荧光。从图中绿色荧 光的分布和强度来看,HepG2细胞在 CBC 材料上 的生长 状 态 非 常 理 想,细 胞 数 量 众 多 且 活 性 高。 CBC材料与 HepG2细胞共培养的过程中,无细胞 死亡或细胞膜受损的情况发生。因此,该结果初步 证明其具有生物相容性。
为评估 CBC 缝线的抑菌性能,分别测试 CBC 对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的生长抑制效果。 如图8所示,CBC试验组的菌落数近乎没有,表明, 与纯 BC 膜相比,CBC 对大肠埃希菌和金黄葡萄球 菌两种细菌的抗菌效果分别达 99.9% 和 93.5%。 该结果是由于EPTMAC属于季铵盐,分子内既存在具 有抗菌活性的季铵阳离子[30-31],又含有反应活性很高 的环氧基团。独特的分子结构使得它能够强有力地吸 附在带有负电荷的细菌表面,从而有效破坏细菌的细 胞结构,抑制其生长和繁殖。
3 结 语
以 BC 为基体,在 NaOH/尿素水体系下,利用 EPTMAC成功对 BC进行不同程度的季铵化改性, 获得不 同 取 代 度 的 季 铵 化 CBC 凝 胶 膜。通 过 拉 伸—加捻—干燥法制备了 CBC缝线,对样品的形貌 结构、红外光谱、结晶性能、力学特性进行了分析,研 究了不同程度化学改性对缝线的影响,并且通过细 胞毒性试验与抗菌试验探索了 CBC 纤维做手术缝 线的基本可能性。结论如下:
BC与 EPTMAC质量比为1∶1时 CBC 缝线力 学性能最好。与纯 BC缝线相比,EPTMAC的引入 可有效降低材料结晶度,提高材料柔韧度。力学性 能结果表明,CBC 缝线因氢键和静电相互作用下, 当比例为1∶1时力学性能得以提升,从 BC 缝线的 (16.1±1.8)N 提 高 至 (21.5±1.1)N,达 到 行 业 标准。
