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1.哺乳动物胚胎干细胞体外培养研究进展
作者：朱丽娜,安雪姣,王海锋,张东强,张瑞,徐振飞,李建烨,岳耀敬
作者单位：中国农业科学院;兰州畜牧与兽药研究所
关键词：胚胎干细胞;生物学特性;胚胎干细胞的获取;体外培养;分子标记
摘 要:胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)是一种来源于早期胚胎的多能干细胞,具有无限增殖、自我更新和多 向分化的特性。 无论在体外还是体内环境,ESCs 都能被诱导分化为机体的大多数细胞类型,这些细胞通常来自于胚 胎体外受精后的早期阶段。 本文根据国内外 ESCs 体外培养的相关研究,对哺乳动物胚胎干细胞的生物学特性、获取、 体外培养及分子标记进行综述,以期为哺乳动物 ESCs 长期培养和建系提供借鉴。
干细胞( stem cell)是一类具有自我更新和分化 能力的细胞群体,可以通过不断的增殖维持自身细胞 群体的规模,从而分化成多种组织细胞类型[1] 。 干 细胞依据其来源可分为胚胎干细胞( embryonic stem cells, ESCs)、成体干细胞(adult stem cells, ASCs)和 诱导 多 能 干 细 胞 ( induced pluripotent stem cells, iPSCs) [2] 。 干细胞被认为是生物学研究、医学治疗 领域和家畜育种改良技术的重要资源,具有多能性、 自我更新能力和分化潜能的特点。 基于干细胞的多 能性和自我更新能力,结合基因编辑等生物技术,可 在畜牧生产中建立针对生长性能、抗病性等特定性状 的精准育种技术体系,为家畜遗传改良提供高效解决 方案。 首先,ESCs 是一类具有自我复制能力和多能 性的细胞,能够分化为多种类型的细胞。 在畜牧业 中,利用 ESCs 进行干细胞育种,可改善动物的生产 性能、健康状况及遗传质量。 通过特定的基因编辑技 术可以改变 ESCs 的基因组,提高动物的生长速度、 抗病能力及肉质的优良特性。 其次,干细胞育种技术 的优势在于它能够提供更为精准和高效的育种方式。 传统的家畜育种主要依赖自然选择与人工定向选育 相结合的方式,但是却有遗传进展缓慢、选育周期长 等缺点,而干细胞技术可直接在细胞水平上进行特定 基因的修饰,使得想要的性状能够更快地在后代中体 现出来。 利用 ESCs 进行克隆技术,可以在短时间内 繁殖出具备优良性状的动物,从而提高整个养殖群体 的生产效率。 最后,在实践中,干细胞育种技术的应 用也面临诸多挑战,包括技术成熟度、成本控制等。 尽管如此,随着技术的不断发展,ESCs 在畜牧生产中 的应用前景广阔,可以推动畜牧业向着更高效、可持 续的方向发展。
ESCs 是一类从早期胚胎内细胞团 ( inner cell mass, ICM) 或原始生殖细胞( primordial germ cells, PGCs)分离出的全能性细胞(见图 1)。 ESCs 具有自 我更新和发育成三胚层甚至完整个体的多能性特征。 研究显示,ESCs 在体外适宜的培养条件下,具有可以 分化产生所有类型细胞的潜能[3-4] 。 ESCs 也是研究 生长发育的良好模型,为细胞治疗、体外模拟疾病和 药物研发提供了重要的初始材料[5] 。 经过多年的研究,人们对 ESCs 的自我更新和多能性这两大特征的 认识已经很丰富,同时为哺乳动物早期发育的研究、 基因编辑技术的开发等提供了强有力的系统模型。 学者们对哺乳动物 ESCs 的研究已持续近 30 年,其中 猪、牛、羊等家畜 ESCs 的体外培养体系构建及多能 性维持已取得了阶段性突破,但仍面临种属特异性差 异显著、表观遗传稳定性不足等技术瓶颈,制约了其 在基因编辑育种和疾病模型开发中的规模化应用。 虽然这些细胞系具有一些多能特性,但很少具备生殖 嵌合能力[6] 。 稳定建系的家畜 ESCs 作为一种高效 生物工具,不仅能够通过全基因组选择加速优良性状 筛选、实现体外配子生成,还可精准编辑多基因调控 的复杂遗传性状,为育种技术创新提供新路径[7] 。 目前分离获得的哺乳动物 ESCs 均不能维持长期稳 定的未分化培养,其中存在多种影响因素,如培养条 件、胚胎发育能力和对生长因子的需求等。 通过优化 ESCs 的体外培养条件,为繁育出优良动物个体、建立 稳定的哺乳动物 ESCs 系和治疗人类及动物某些疾 病提供新的思路和方法。 本文综述了近年来 ESCs 作为新的育种工具在哺乳动物生产中体外培养方面 的最新进展,以期为哺乳动物 ESCs 长期培养和建系 提供参考。
1 不同哺乳动物 ESCs 的首次研究
不同哺乳动物 ESCs 的首次研究为了解干细胞 生物学提供了关键突破。 1981 年,M. J. Evans 等[8] 首次从小鼠早期胚胎中成功分离出 ESCs,并建立了 小鼠 ESCs 系,发现小鼠胚胎的内细胞团可以在适当 条件下无限繁殖。 1998 年,J. A. Thomson 等[9] 首次 从人类胚胎中成功分离出 ESCs 并进行长期的体外 培养,发现其能持续维持生长并保持不分化的状态。 1995 年,J. A. Thomson 等[10] 首次从猕猴胚胎中成功 分离出 ESCs,并将其培养成猕猴 ESCs 系,这一发现 证明了哺乳动物 ESCs 的存在,并为猕猴成为重要的 模型动物提供了更多的研究工具和资源。 之后又相 继分离得到了绵羊、猪、牛、灵长类动物的 ESCs。 但 是,家畜 ESCs 的分离一直是一个长期的挑战,1987 年, A. Handyside 等[11]使用绵羊皮肤成纤维细胞和胎儿 成纤维细胞作为饲养层,培养出了内胚层样细胞。 1981 年,G. R. Martin [12] 首次从绵羊早期胚胎中成功 分离出 ESCs,并将其培养成绵羊 ESCs 系,这项研究 是继小鼠和猕猴之后,首次在大动物中实现了 ESCs 的分离和培养。 绵羊 ESCs 的成功分离和培养为研 究生物学、基因编辑技术、生物医学工程等领域提供 了新的工具和资源。 1990 年,J. A. Piedrahita 等[13]通 过试验获得了传代一年后仍未失去其表面标记的猪 的类 ESCs。 2021 年,Zhi M. 等[14]首次从猪早期胚胎 中成 功 分 离 出 ESCs, 并 将 其 培 养 成 猪 ESCs 系。 1992 年, S. Saito 等[15] 在 含 有 白 血 病 抑 制 因 子 (leukemia inhibitory factor,LIF)的培养基中培养羊和 牛的内细胞团,成功分离出了生长缓慢的牛 ESCs 样 细胞群落。 2018 年,Y. S. Bogliootti 等[16] 从体外生产 的牛囊胚中分离出稳定的牛 ESCs。 不同哺乳动物 ESCs 的首次建系见表 1。
2 ESCs 的生物学特性
2. 1 形态特征
ESCs 的形态结构通常呈圆形且细胞体积相对较 小,相比于其他细胞,ESCs 的细胞核通常较大,核质 比例较高[17] 。 体外培养时,ESCs 通常呈圆顶状生 长,细胞克隆边缘清晰,表面较光滑,具有一定的折射 性,胞质相对较丰富,含有大量的细胞质基质。 在培 养条件下,ESCs 有时会以聚集的方式生长,形成细胞 聚落或胚胎体外囊胚[9] ,人类 ESCs 系 H9 的分离过 程见图 2。 在培养和处理 ESCs 时,研究人员通常会 根据这些特征来识别和鉴定 ESCs 的状态和纯度。
2. 2 分化特征
J. A. Thomson 等[9]首次报道了人类 ESCs 系的建 立,这一发现引发了科学界对 ESCs 的全能性和多能 性的深入研究。 ESCs 具有全能性和多能性,可以分 化为人体内的所有细胞类型,因此被认为是再生医学 的理想细胞来源[18] 。 这一发现为再生医学、药物研 发及疾病治疗等领域提供了巨大的潜在应用价值,也 成为生物医学领域的重要突破之一。
2. 2. 1 全能性
ESCs 是一种高度未分化细胞,研究 和利用 ESCs 是当前生物工程领域的核心问题之一。 ESCs 的全能性是指在适当的条件下可以发育成为完 整动物体的潜力[19] ,这种全能性使 ESCs 成为细胞遗 传操作和细胞分化研究的重要工具,为研究人员提供 了丰 富 的 试 验 材 料 和 研 究 平 台。 通 过 基 因 编 辑 (CRISPR/ Cas9 技术)可在 ESCs 中模拟特定的突变, 从而研究疾病的发病机制及其潜在的治疗方法;也可 用于移植的细胞和组织,如心脏、神经和胰腺细胞等, 为治疗损伤或退行性疾病提供了新的可能性。 研究 ESCs 的自我更新和分化机制可以深入理解发育生物 学中的基本原则,如胚胎发育过程中的细胞信号传导 和基因调控。 在研究 ESCs 的全能性时,研究人员通 常会观察和检测一些特定的标记物来进行鉴定。 例 如,ESCs 中高度表达的阶段特异性胚胎抗原( stagespecific embryonic antigen,SSEA) 可以被免疫系统识 别并产生相应的免疫反应。 当免疫系统检测到胚胎 抗原时,会产生针对这些抗原的免疫反应,包括产生 抗体、激活免疫细胞等过程,从而帮助清除异常细胞 或组织[20] 。 八聚体结合转录因子 4(octamer-binding transcription factor4, Oct4)基因通过调控基因的转录 活性,参与维持 ESCs 的状态并调控细胞命运,是胚 胎发育和干细胞研究中的一个非常重要的分子调控 因子[21-22] 。 此外,碱性磷酸酶( alkaline phosphatase, AP)和端粒酶活性的水平也被用来鉴定 ESCs 的全能 性。 AP 在 ESCs 中的作用主要是识别和标记细胞、 维持干细胞状态及监测细胞的分化状态[23] 。 高水平 的 AP 活性和端粒酶活性通常与 ESCs 的干细胞特性 相关联[24] 。 通过检测这些标志物和活性,可以更准 确地确认和鉴定 ESCs 的发育全能性,进而在研究和 应用中更好地利用这些细胞。
2. 2. 2 多能性 ESCs 的多能性是指 ESCs 具有发 育成多种组织的能力,参与部分组织的形成。 将 ESCs 培养在不含分化抑制物的培养基上,可以形成 类胚体( embryoid bodies, EBs) [25] 。 将 ESCs 用特定 培养基进行培养,可以定向分化成特定组织,再从培 养基中去除 LIF 并添加低剂量的全反式维甲酸(RA) 后,可以诱导小鼠 ESCs(mouse embryonic stem cells, mESC)进行分化。 ESCs 具有多能性,能够分化为外 胚层、中胚层及内胚层的细胞组织,但在注入囊胚后 无法形成胚外组织[26-27] 。
2. 2. 3 体外扩增 ESCs 的体外扩增是指在实验室 条件下,将少量的 ESCs 通过培养和有丝分裂,使其 增殖成大量的细胞群体的过程。 也可对其进行遗传 操作,如导入异源基因、报道基因或标志基因、诱导基 因突变等[28] 。 对 ESCs 进行扩增、遗传操作及冻存均 不会使其丧失多能性,此外,冻存的 ESCs 解冻后不 会失去其原有特性[29] 。
3 ESCs 的获取途径
3. 1 内细胞团细胞
1981 年,M. J. Evans 等[8] 从囊胚的内细胞团分 离出了第一株 mESCs,通过分离内细胞团中的细胞, 可以获得大量的 ESCs,这些细胞具有自我更新和多 向分化的能力,因此在生物医学研究和临床治疗中有 广泛的应用。 到目前为止,已成功建系的各种 ESCs 基本来自于内细胞团, 包括受精囊胚[30] 、 孤雌囊 胚[31]及克隆囊胚[32]等。
囊胚内细胞团的分离处理方法通常采用全胚培养法、机械切割法[33] 、免疫外科手术法和酶消化法[34-37] 。
3. 1. 1 全胚培养法 将囊胚放入含有适当营养物质 的 ESCs 培养基中,促使其自然发育并形成集落;随 后选择突出的内细胞团,并将其进行体外培养以进一 步研究和利用这些干细胞。 这种方法的优点是几乎 不会损伤细胞,能确保内细胞团的完整性,并且分离出 来的细胞团状态良好;但也存在一些缺点,如胚胎贴壁 率会受到饲养层状态、胚胎发育状态和胚径大小等多 种因素的影响,导致胚胎贴壁率不高。
3. 1. 2 机械切割法 此方法是在全胚培养法的基 础上操作,去除透明带后,用玻璃针或注射器针头将 胚胎分为两半:一半为滋养层细胞,另一半为含有 ICM 和少量滋养层细胞。 将后者进行培养,滋养层扩 散后可用吸管分离到 ICM。 缺点是在操作中仍可能 对细胞造成一定的物理伤害,影响细胞的存活率和功 能。 虽然操作简单,但如果操作不当,可能导致内细 胞团的破坏或污染,对试验结果产生负面影响,难以 获得高度纯净的内细胞团(可能夹杂其他细胞或组 织),影响后续研究的准确性。
3. 1. 3 免疫外科手术法 使用链霉蛋白酶去除囊胚 的透明带,再用兔抗血清抗体处理囊胚,处理后的囊 胚再用含有豚鼠补体的液体处理;经抗原-抗体作用 的滋养层变得肿胀松散后,再经吹打将其去除;最后 将得到的内细胞团在饲养层上进行培养。 其缺点是: 1)会带来一定的风险,包括感染、出血;2) 涉及复杂 的操作,需要具备专业技能的外科医生,增加了人工 成本和技术难度。
3. 1. 4 酶消化法 酶消化法主要的酶溶液为胰蛋白 酶,在此过程中,胚胎被暂时暴露在特定的酶溶液中, 这些酶可以分解外细胞团,从而将 ICM 分离出来。 酶消化法的优点包括操作相对简单、ICM 分离效果较 好。 然而,这种方法也存在一些限制,如对胚胎处理 的操作要求高,且有时可能会损伤到 ICM 细胞。
3. 2 囊胚之前的早期胚胎
干细 胞 也 可 取 自 囊 胚 之 前 的 早 期 胚 胎。 F. Delhaise 等[38]使用 52 枚 8-细胞期的小鼠胚胎,将其 消化成单个卵裂球后培养在饲养层上,该细胞系具有 畸胎瘤形成、三胚层分化与产生嵌合体的能力。 H. Tojo 等[39] 也使用了相同的方法,从 C5BL / 6×DBA/ 2 杂交小鼠的 8-细胞胚胎中成功获得了 ESCs。
3. 3 着床后的胚胎
受精卵成功着床在子宫内膜上就形成了着床后 胚胎,是哺乳动物胚胎发育过程中的一个关键阶段。 着床后的胚胎在发育过程中会经历一系列的分化和 增殖。 最初,胚胎会通过细胞分裂形成囊胚,在囊胚 形成后,胚胎细胞会进一步分化形成不同的胚层(外 胚层、内胚层和中胚层),并最终发展成不同的组织 和器官。 P. J. Tesar 等[40] 和 I. G. Brons 等[41] 分别从 5. 5~7. 5 d 的小鼠或大鼠着床胚胎的外胚层中分离 得到了表皮干细胞(EpiSC)。 与 ESCs 相比,小鼠的 EpiSC 更接近人类的 ESCs [42] 。
3. 4 原始生殖细胞
研究发现,最早能清楚分辨出小鼠原始生殖细胞 (PGC)的时间在胚胎发育 7~7. 25 dpc(交配后天数) 时。 在位于胚胎远端的中胚层内,存在表达 AP 和 Oct4 转录因子的 PGC,之后迁移到内胚层[43] 。 在原 肠作用结束时,PGC 有 50 ~ 80 个;在 8 dpc 的后肠内 胚层和尿囊基部, PGC 约有 125 个[44] ;在 8. 5 dpc 时,PGC 开始迁移;在 9. 5 dpc 时,PGC 迁移到背肠系 膜;在 10. 5~12. 5 dpc 时,PGC 沿背肠系膜迁移到生殖 嵴。 在迁移过程中,PGC 经 5~ 6 次分裂,其数量增加 到约 4 000 个,到 13. 5 dpc 时,PGC 约有 2. 6 万个[45] 。 在适宜的微环境和多种细胞因子的作用下,PGC 可以转化为 ESCs [45] 。 白细胞介素(interleukin, IL) / LIF 家族细胞因子、Oct4 及同源盒转录因子(NANOG homebox,Nanog ) 基 因 可 维 持 PGC 的 未 分 化 状 态[46-47] 。 干细胞因子( SCF)、LIF、碱性成纤维细胞 生长因子(bFGF)与其受体相结合,激活细胞内相应 的信号传导通路[48-49] 。 三者联合作用能使细胞内环 磷酸腺苷(cAMP)浓度升高,使得 PGC 发育程序发生 改变,阻断了其终末分化,刺激其扩增,得到胚胎期的 生殖干细胞也叫做“原始生殖细胞” ( embryonic germ cells, EGCs)系[50] 。
3. 5 克隆胚
研究人员通过将人的皮肤细胞与 ESCs 融合,使 得体细胞的核内遗传信息重新编辑,从而使体细胞具 有多能性或全能性[51] 。 H. Kimura 等[52] 研究了融合 细胞的表观遗传,发现在 Oct4 等基因的启动子区域 表达类似于 ESCs 基因的表观遗传状态,包括组蛋白 的乙酰化和甲基化等,表明体细胞基因组可被融合的 ESCs 重新编辑。 A. G. Smith 等[53] 将神经干细胞与 ESCs 融 合 后 发 现 出 现 了 Nanog 的 过 表 达 现 象。 Nanog 是在早期小鼠胚胎和 ESCs 中表达的转录因 子[54] 。 在小鼠 ESCs 中,过表达的 Nanog 可以在缺乏 LIF 的环境中维持细胞的自我更新[55] 。 同样在人的 ESCs 中,过表达的 Nanog 可以使细胞在没有饲养层 细胞的条件下继续生长,说明融合后的细胞具有了一 些 ESCs 的遗传特性[55] 。
4 ESCs 的体外培养
ESCs 的体外培养需要特定的培养基来维持其未 分化状态和多潜能性,并促进其无限增殖[56] 。 在传 统的 ESCs 培养中,常使用饲养层细胞(如小鼠胚胎 成纤维细胞或小鼠胚胎成纤维上清液)作为支持层, 提供必要的细胞与细胞相互作用和信号传导,以维持 ESCs 的未分化状态[57] 。 影响 ESCs 体外培养的主要因素有培养基的成分、细胞因子的选择、饲养层的制 备等。 不同家畜 ESCs 的研究进展见表 2。
4. 1 培养基
4. 1. 1 无血清培养基(serum-free media, SFM)
目 前 ESCs 体外培养的培养基主要为无血清培养基[61] 。 无血清培养基是指在细胞培养中不需要添加血清,但 是在某些应用中可能要添加生长因子 或 细 胞 因 子[62] 。 无血清培养基可以避免添加血清时引入多种 未知因素的影响,减少细胞培养中不确定因素的干 扰[63] 。 无血清培养基中添加了血清的主要成分黏附 因子、生长因子、必需的营养物质和激素等,能减少血 清带来的不利因素,使细胞培养的条件更稳定[64-65] 。 经历了天然培养基、合成培养基后,无血清培养基成 为当今细胞培养领域的一大趋势。 Y. S. Bogliotti 等[16] 使用 mTeSR1 基础培养基有 效地从囊胚中获得牛 ESCs(CTFR-bscs)。 此外还有 2iL、NHSM、4I、FAC 等无血清培养基[59] 。 采用上述 限定性培养基可以提高人 ESCs 培养的重复性、规模 性和操作性。 目前市场上有一些可替代人血清白蛋 白的限定性培养基,如 TeSR2 和 PSGRO;还有不含血 清蛋白组分的培养基,如 Essential8、TESR-E8 和 XVivo,均含有重组生长因子和经过高度纯化、药品级 别认证的人血清白蛋白[64] 。
4. 1. 2 无血清、无饲养层细胞的 ESCs 培养体系 为 了减少或消除动物源性成分所带来的干扰,确保临床 细胞治疗应用的安全性和有效性,研究人员研究出了 ESCs 的无血清、无饲养层细胞或无异源物质的培养 技术[66] 。 为了获得真正的无异源物质的培养体系, 至少要解决三个问题:1) 不能使用动物源性饲养层 细胞;2)选择无动物源性的蛋白质;3)在去除滋养外 胚层得到囊胚内细胞团细胞时,不能使用异源性抗 体。 该培养体系由于不使用动物源性成分,减少了 来源不明的污染风险,如细菌、病毒和其他微生物 的污染,为无血清、无饲养层的培养条件提供了更 一致的试验环境,从而提高了试验结果的可重复性 和可靠性;使用合成或植物基的培养基可以降低对 高成本动物源性成分的依赖,减轻整体培养成本; 限定性培养基可以优化细胞的生长条件,使细胞在 特定的生理状态下生长,从而更好地研究细胞的功 能和特性;无异源成分的培养体系能够消除外源性 成分对细胞生长的影响,使得对细胞特性的研究更 加精确和可靠[67] 。 不同培养基对 ESCs 体外培养的 影响见表 3。
4. 2 细胞因子
细胞生长因子对 ESCs 的自我更新起着重要的作 用[70] 。 ESCs 和多能干细胞表面抗原 SSEA4、TRA-1 - 60、TRA-1-81 的表达及核多能性标记物 Oct3 / 4 和 Sox2 的表达,都是评估细胞多能性的重要指标[69,71] 。 转化生长因子-β(transforming growth factor-beta,TGFβ)与胰岛素样生长因子 2( insulin-like growth factor 2,IGF2)协同成纤维细胞生长因子( fibroblast growth factor,FGF),维持人 ESCs 在无血清培养状态下细胞 内的调控平衡[72-74] 。 bFGF 可使细胞保持未分化的 状态,是干细胞培养基中的重要成分之一[75] 。 HGF 能促进干细胞的增殖、迁移,对维持干细胞的功能至 关 重 要[76] 。 LIF、 骨 形 态 发 生 蛋 白 4 ( bone morphogenetic protein 4, BMP4 )、 ERK 抑 制 剂 (ERKi)、GSK3β 抑制剂(GSK3i)激活素 A 等都有利 于 ESCs 发育潜能的维持[76] 。 P. A. Marinho 等[77] 进 一步证明了 IWR1 和 FGF2 对于维持绵羊 ESCs 的未 分化状态至关重要。
4. 3 饲养层细胞
饲养层是一种常用的细胞培养技术,具有黏附能 力(如成纤维细胞、间充质干细胞等)。 ESCs 在进行体外培养时,要维持其细胞的未分化状态和多潜能 性,也要使其无限增殖[78] 。 K. P. Kim 等[79] 研究发 现,ESCs 只有在饲养层细胞上或在含 LIF、 FGF2、 IGF2 细胞因子时,才能保持未分化状态。 在无饲养 层细胞或不含条件培养基时或在单层细胞培养条件 下,干细胞趋向分化[80] 。
饲养层细胞经过丝裂霉素 C 或辐射处理,可抑 制其增殖的饲养层细胞,还可为 ESCs 的生长提供所 需的生长因子,维持 ESCs 的正常生长[81] 。 常用的饲 养层细胞包括:1)建立的猴病毒 40 型(SV40)转化的 鼠胚胎成纤维细胞(simian virus 40-transformed mouse embryonic fibroblasts, STO),该饲养层是经过 SV40 转 化的小鼠胚胎成纤维细胞,STO 具备癌变特征和更强 的增殖 能 力[82] ; 2) 小 鼠 胎 儿 成 纤 维 细 胞 ( mouse embryonic fibroblasts, MEF)取自小鼠胚胎的成纤维细 胞,未经过病毒转化,属于正常、非癌变的成纤维细胞, 可以为其他细胞提供适当的生长微环境,且相对接近 自然 状 态[83] ; 3) 人 同 源 胎 儿 成 纤 维 细 胞 ( human embryonic fibroblasts, HEF)从人类早期 2~3 周大的胚 胎中提取,属于正常的成纤维细胞,HEF 能够为其他细 胞提供牢固的黏附基础,能分泌多种细胞因子、激素和 生长因子促进其他细胞的生长与分化[84] 。
5 家畜 ESCs 的分子标记
细胞通过受体和结合蛋白相互作用来发挥相应 的功能,其表面受体就是干细胞标记物[85] ,见表 4。 研究人员发现,一些分化抗原或膜分子可以作为干细 胞的标记物[86] 。 这些标记物可以帮助鉴定和分离干 细胞,通过标记特定的分子,可以识别和分离出具有 干细胞特性的 ESCs 群[87] 。 一些分子标记如 Oct4、 Sox2 和 Nanog 等转录因子,对于维持 ESCs 的干性状 态至关重要。 它们通过调控基因表达,促进干细胞的 自我更新和增殖,阻止其向分化状态转变。 Oct4、 Sox2 和 Nanog 及其他干细胞特异性基因可以维持 ESCs 的多能性,确保它们能够分化成各种不同类型 的细胞[88] 。 分子标记在 ESCs 的研究和应用中至关 重要,不仅能帮助确定细胞命运(如维持干性或启动 分化),还能作为评估和监测 ESC 质量的核心指标。
6 结论
ESCs 体外培养技术作为家畜育种领域的技术手 段之一,具有很大的研究前景。 首先,ESCs 具有无限 增殖、自我更新、多向分化的潜能,可以诱导分化为各 种细胞类型。 在对哺乳动物 ESCs 的研究中,尽管已 经取得了显著进展,但在某些方面还有待进一步的探 索和研究,例如培养基的优化、建立稳定的动物细胞 系等。 内细胞团的获取是从早期胚胎中提取干细胞 的首要步骤,为后续的研究提供了基础。 成功提取内 细胞团可以保证获得高质量的 ESCs,这些细胞具有 良好的增殖能力和多能性。 ESCs 体外培养技术的发 展使研究人员能够在实验室环境中长期维持和扩增 这些细胞,不仅为研究细胞分化提供了条件,还为药 物筛选、基因编辑等研究提供了充足的细胞来源。 通 过分子标记技术,可以有效地追踪和分析 ESCs 的分 化过程,确定哪些因子在维持干细胞特性和调控细胞 命运决策中起关键作用,为揭示细胞如何响应外界信 号、选择命运路径等提供了重要信息。 通过建立多种 哺乳动物的 ESC 系,研究范围得以扩展,使研究人员 能够在小鼠、猴子和人类等不同模型生物中交叉验证 研究成果。 这种跨物种的比较研究有助于识别共性 机制,推动再生医学和治疗性干预的发展。
尽管 ESCs 研究已取得显著进展,但其自我更新 调控机制解析、定向分化效率提升及细胞异质性控制 等核心瓶颈问题仍需进一步突破。 例如,如何更有效 地调控 ESCs 的分化方向和效率,如何提高 ESCs 的 存活率和稳定性等问题还需要在未来的研究中进一 步探索和解决。
展望未来,随着科技的发展和研究手段的不断创 新,ESCs 研究会取得更大的突破。 无论是在基础理 论研究还是在临床应用方面,ESCs 都有着广阔的应 用前景。 未来希望更多的科研成果能够推动这一领 域的发展,为人类和动物健康带来更多的可能。
