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1.不同成分稀释液对鸡精液超低温冷冻保存的影响
作者：许文武,马敏彪,白丽娟,卢立志,孙寒雪,熊希怀
作者单位：浙江省农业科学院;省部共建农产品质量安全危害因子与风险防控 国家重点实验室;浙江省畜牧技术推广与种畜禽监测总站
关键词：鸡精液;冷冻稀释液;复苏后活力;受精率;孵化率
摘 要：为探究不同成分稀释液对鸡精液超低温冷冻保存的影响，本实验采集 180 日龄的灵昆鸡、马站红鸡和 温岭草鸡精液，以 IGGKP、LAKE 和 BPSE 稀释液为对照组，以 256、256-5、256-6 以及 256-8 稀释液为实 验组进行上述 3 种鸡精液的冷冻保存实验。并根据初步实验结果挑选 LAKE 组和 256-8 组测定保存后精子的 受精率与孵化率。结果显示：在灵昆鸡中，256-8 组的精液活力显著高于对照组；在马站红鸡和温岭草鸡中， 256-8 组的精液活力显著高于 IGGKP 和 BPSE 组。在人工授精实验中，256-8 组在灵昆鸡和马站红鸡中的受 精率和孵化率显著高于 LAKE 组，而在温岭草鸡中无显著差异。本实验结果表明 256-8 稀释液不仅在精液复 苏后活力上高于 IGGKP 和 BPSE 稀释液，受精率、孵化率也显著高于 LAKE 液。
随着我国家禽养殖业的规模化和集约化程度越来 越高，人工授精技术得到广泛应用 [1] ，目前人工授精 技术主要依赖于精液冷冻。鸡精液冷冻研究最早开始 于 1941 年，Shaffner 等 将 鸡 精 液 于 -6 ℃ 保 存 30 s 后 进行人工授精，成功孵化出 1 只雏鸡。Polge 等 [2-3] 在 1949—1951 年意外发现甘油在冷冻条件下（-79℃）对 精子有保护作用，便开始将甘油添加到鸡精液稀释液中， 实现了鸡精液的超低温保存。近年来，中国科学院大学 通过增加与减少鸡精液稀释液中的高成本物质 N- 三羟 甲基甲基 -2- 氨基乙磺酸（TES）用量，配制成不同稀 释液与原精等比稀释，与种鸡场现有稀释液比较精子活 力和输精效果，结果显示降低 TES 与渗透压后稀释液 仍能维持精子活力、受精率和孵化率 [4] 。不同品种家禽 的精液冷冻仍存在冷冻后精子存活率低，输精后孵化率 不高等问题，因此该技术还需要进一步优化 [5] 。
在精液冷冻过程中，冷冻对精子的直接损伤是影响 精液品质的主要因素。为确保鸡精液在冷冻过程中保持其生物活性和受精能力，冷冻前添加稀释保护液是减少 损伤的有效方法 [6] 。鸡精液稀释液需要根据精液本身的 特性，从营养物质、渗透压、pH、缓冲能力、抗冻剂等 诸方面进行考虑 [7-9] 。目前已有多种冷冻稀释液应用于 鸡精液冷冻保存，但不同品种的研究结果差异较大 [10] 。 何孟纤等 [11] 发现 Lake's 稀释液对广西容县霞烟鸡精 液冷冻后的精子活率、活力和顶体完整性保护效果最 佳，而 Rakha 等 [12] 研究发现红羽鸡稀释液（Red Fowl Extender）与 LAKE、EK 等稀释液相比更能维持印度 丛林红禽的精液活力。本实验探究不同成分稀释液对鸡 精液超低温冷冻的影响，筛选出更适于不同地方品种的 精液冷冻稀释液，为鸡种质资源的收集与保护奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物 本实验选用 180 日龄健康的马站红鸡 公鸡 16 只、灵昆鸡公鸡 42 只和温岭草鸡公鸡 28 只， 以及上述鸡种母鸡各 20 只。马站红鸡来自于温州市农 业科学院马站红鸡保种场，灵昆鸡来自于温州市洞头区 的浙江省灵昆鸡祖代种鸡场，温岭草鸡来自于浙江省温 岭市温岭草鸡合作社。
1.1.2 精液采集及选择 鸡精液通常为乳白色或略带黄 色的乳状液体。实验采用背腹式按摩法采集精液，挑选 3次采精精子平均活力在0.6以上的精液用于冷冻试验。
1.2 实验方法
1.2.1 实验设计 本实验以 IGGKP、LAKE 和 BPSE 稀 释液作为对照组，以重新配制的 256、256-5、256-6 以 及 256-8 稀释液为试验组，选取 180d 健康的马站红鸡 公鸡 16 只、灵昆鸡公鸡 42 只和温岭草鸡公鸡 28 只， 以及上述鸡种母鸡各 20 只为实验对象。比较 3 个品种 鸡精液冷冻复苏后活力、受精率和孵化率。
1.2.2 冷冻稀释液和保护液的配制 将已有的 3 种稀释 液作为对照组，重新配制 256 稀释液并调整配方形成 256、256-5、256-6 以及 256-8 稀释液。以 10% 的甘油 作为保护剂添加到各组稀释液中形成保护液，保护液甘 油终浓度为 5%[13] 。100 mL 体系中各稀释液成分及比例 见表 1 和表 2。
1.2.3 精液的稀释及冷冻 选取活力合格且无粪无血的 精液，将精液与稀释液等比例混合，于 4℃冰箱放置 30 min，后等比例加入含 5% 甘油的保护液，于 4℃冰箱再放置 15 min；
将稀释好的精液转移置冻精细管并 使用聚乙二醇粉末封口，标记后置于液氮上方 2~3 cm 处熏蒸 10 min 再投入液氮冷冻。冷冻 24 h 后进行解冻 复苏，解冻温度为 4℃。
1.2.4 3 个鸡品种解冻复苏后活力对比 将马站红鸡、 温岭草鸡和灵昆鸡解冻复苏后的精液置于 4℃条件下， 在 Hamilton Thorne 精子分析仪温控板上观测并计算精 子活力。
1.2.5 3 个鸡品种人工授精孵化率、受精率对比 将马 站红鸡、温岭草鸡和灵昆鸡冷冻复苏后的精液进行人工 输精。3 个品种各 20 只母鸡，输精量均为 0.25 mL，首 次输精连续 2 d，后隔 3 d 输精 1 次，共进行 4 次；第 3 天开始收集种蛋并编号入孵，共收集 8 d 每组约 120 枚； 入孵后10 d进行照蛋检测，正常受精的继续孵化至出雏， 统计孵化情况。
1.3 统计与分析
数据用 Microsoft Excel 2013 软件进 行整理，采用 SPSS20.0 软件进行单因素 ANOVA 方差 分析，以 P作为差异显著判断标准。试验结果以 平均值 ± 标准差表示。
2 结果与分析
2.1 灵昆鸡精液超低温冷冻复苏活力 由表 3 可知， 256-8 稀 释 液 精 子 复 苏 活 力 显 著 高 于 同 种 保 护 剂 下 IGGKP 液、LAKE 液和 BPSE 液。256、256-5 和 256-6 稀释液精子复苏活力显著低于同种保护剂下 256-8 液、 IGGKP 液、LAKE 液和 BPSE 液。
2.2 马站红鸡精液超低温冷冻及复苏活力 由表 4 可知， 256-8 稀释液复苏后精子活力显著高于同种保护剂下 IGGKP 液和 BPSE 液。256、256-5 和 256-6 稀释液复 苏后精子活力显著低于同种保护剂下 256-8 液、IGGKP 液、LAKE 液和 BPSE 液。
2.3 温岭草鸡精液超低温冷冻及复苏活力 由表 5 可知， LAKE 液和 256-8 稀释液复苏后精子活力显著高于同种 保护剂下 IGGKP 液和 BPSE 液。256、256-5 和 256-6 稀释液复苏后精子活力显著低于同种保护剂下 256-8 液、IGGKP 液、LAKE 液和 BPSE 液。
2.4 稀释液 256-8 冻存后精液在 3 个鸡品种中受精率和 孵化率对比 根据上述结果挑选 LAKE 液与 256-8 稀 释液进行 3 个地方鸡的人工授精，结果如表 6 所示，同 样以甘油为保护剂，在灵昆鸡中 256-8 稀释液受精率和 孵化率显著高于 LAKE 液，在马站红鸡中 256-8 稀释液 受精率显著高于 LAKE 液，在温岭草鸡中二者孵化率 与受精率无显著差异。
3 讨 论
在家禽精液冷冻保存过程中，有多种因素会对精子 活力造成影响，如在冷冻和融冻过程中容易使精子尾部 断裂使其无法游动 [14] ，在高渗透压环境中精子会出现 “暂时性休克”现象 [15] 。而合适的稀释液能够为精液 提供所需的营养物质，保持电解质平衡，维持精子 pH 和渗透压，从而减少冷冻过程中精子的损伤 [16] 。由于 不同的品种和家系间精子的理化性质存在差异，其对低 温的耐受性也有所不同 [17] ，因此，针对不同的品种进 行稀释液成分的优化研究仍需不断的改进和完善 [18-20] 。
本研究结果表明，在灵昆鸡、马站红鸡和温岭草 鸡精液的超低温冷冻复苏试验中，使用 256-8 稀释液复 苏后活力显著高于 IGGKP 和 BPSE 稀释液，且略高于 LAKE 液。在人工授精实验中，使用 256-8 稀释液的受 精率均显著高于 LAKE，孵化率同样有所提高。
鸡精液冷冻稀释液的 pH、渗透压和营养成分等都 是影响鸡精液质量的重要因素。稀释液中添加磷酸二氢 钠和磷酸氢二钠等缓冲剂，在常温条件下能够延长鸡精 子存活时间至 72 h，可以保护精子的正常形态和活力 [5] 。
不同营养成分的添加对稀释液的保护效果也有所不同， 张兆旺等 [21] 发现在家禽稀释液中添加果糖的保护效果 优于葡萄糖，并证实精子分解葡萄糖速度很快；而张彩 云等 [22] 发现在短期保存中添加葡萄糖的效果优于果糖； 在本实验中添加葡萄糖的 256-8 稀释液对鸡精液冷冻保 存效果更好，可能是因为稀释液中的糖类并不是独立存 在，保存效果可能会受其他物质的影响。
本实验中 256-8 稀释液对鸡精液冷冻保存效果较好 的另一原因可能是其含有一定量的柠檬酸钾和氯化镁。 关定国等 [23] 发现在鸡精液稀释液中添加柠檬酸钾能够 提高精子生存指数，少量的 K+ 、Mg2+ 能延长鸡精子在 体外的寿命。而本实验中 BPSE 稀释液的效果较差， 可能是因为其中的磷酸二氢钾和磷酸氢二钾都能提供 K+ ，导致其含量过高。少量的 K+ 是维持精子正常活力 所必须的，但过量的 K+ 会降低精液低温保存效果。
本实验结果表明 256-8 稀释液在鸡精液冷冻保存过 程中具有较好的保护效果，但并未对稀释液中具体物质 的作用做深入研究，也没有在其他鸡品种上进一步验证， 未来需要做进一步研究。
4 结 论
本实验结果显示，与传统稀释液相比，256-8 稀 释液与含 5% 甘油的保护液配置成稀释保护液能更好 地维持鸡精液冷冻复苏活力，一定程度上提高受精率 和孵化率。
2.选择性剪切的作用机制及其在猪遗传育种中的应用研究进展
作者：张舒演,盛熙晖 ,王 妍,齐晓龙,曹永春,邢 凯
作者单位：北京农学院动物科学技术学院;中国农业大学
关键词：选择性剪切;剪切机制;猪生产性状;mRNA
摘 要：选择性剪切作为一种关键的转录后调控方式，极大地丰富了蛋白质组的多样性。选择性剪切不仅在调 控基因表达中发挥着重要作用，而且保证了生物体复杂的调控网络和强大的环境适应能力。但是，目前选择 性剪切在猪上研究较少，该领域仍存在诸多待深入挖掘的未知机制和关键问题。本文旨在综述选择性剪切的 调控机制，并深入探讨选择性剪切在猪重要性状中的作用及对育种的影响，挖掘选择性剪切的潜在应用前景， 为猪的基因表达调控机制提供理论参考，并为猪的遗传育种奠定坚实的理论基础。
真核生物的基因结构多表现为不连续性，基因编码 序列之间至少存在一个间插序列，这些编码序列被称为 外显子，间插序列被称为内含子。DNA 转录形成的前 体 mRNA（precursor mRNA，pre-mRNA）中包含大量 内含子，内含子在经历特定剪切反应后被去除，外显子 则以精确的顺序连接成为成熟的 mRNA，成熟 mRNA 翻译成蛋白质。从前体 mRNA 到成熟 mRNA 的转变过 程被称为 RNA 剪切 [1] 。
mRNA 选 择 性 剪 切（Alternative Splicing，AS） 就是前体 mRNA 在特定机制下，有选择地识别剪切 位点并进行 RNA 剪切和重连，最终形成不同的成熟 mRNA，从而翻译成不同的蛋白质亚型 [2] 。单个基因通 过 AS 可以表达不同的 mRNA，编码相关功能、不同功 能甚至拮抗功能的蛋白质亚型 [3] ，最终影响基因的调控 功能及效率。AS 是生物体基因转录后调控的基本方式 之一，对蛋白质种类及功能的多样性有着深远影响。随 着测序技术的不断发展，人们建立了众多数据库用于对 AS 进行筛选，通过分子生物学技术验证了 AS 在调节 动物发育和生理功能等方面具有十分重要的影响 [4] 。
在多细胞真核生物中，AS 与转录调控共同决定基 因表达，对维持生物体正常生理功能具有至关重要的作 用，例如细胞分裂、细胞凋亡、胚胎与成体组织分化、 细胞对多种环境因子的响应等生理活动 [5] 。因此，深入 探究 AS 作用机制对于研究真核生物的基因表达过程具 有举足轻重的作用。在猪生产性状的基因表达过程中 AS 也扮演着关键角色，对优良种猪的选育有重要作用。 本文综述了 AS 产生机制及其调控机制的研究进展，并 探讨 AS 在猪生产性状中的具体作用及其在未来研究中 的应用前景，为进一步了解猪基因表达过程提供更全面 的认识，同时为猪育种领域的研究提供理论基础和启示。
1 AS 的产生机制
AS 的基本过程首先是 DNA 转录生成未成熟的前 体 mRNA，然后前体 mRNA 在剪切体和 RNA 结合蛋 白等调控因子的作用下，有选择地确定剪切位点进行 RNA 剪切，然后外显子进行重连成为成熟 mRNA 的过 程，最终形成不同的成熟 mRNA[6] 。
1.1 AS 的类型 AS 主要包括 5 种基本方式：外显子跳 跃（Skipped Exon，SE）、5' 端选择性剪切（Alternative 5' Splice Site，A5SS）、3' 端选择性剪切（Alternative 3' Splice Site，A3SS）、外显子互斥（Mutually ExclusiveExon，MXE） 以 及 内 含 子 保 留 [4] （Retained Intron， RI）（图 1）。
前体 mRNA 剪切完成后，进行 mRNA 外显子重连 时，部分外显子被忽略而未进行重连，被称为 SE。前 体 mRNA 剪切时，前体 mRNA 的 5' 端发生的不同位 点的剪切，被称为 A5SS。前体 mRNA 剪切时，前体 mRNA 的 3' 端发生的不同位点的剪切，被称为 A3SS。 前体 mRNA 剪切完成后，进行 mRNA 外显子重连时， 2 个外显子之间发生排斥反应，导致这 2 个外显子不能 共存于成熟 mRNA 中，只能保留其中 1 个外显子的剪 切，称为 MXE。前体 mRNA 剪切完成后，进行 mRNA 外显子重连时，内含子被当成外显子进行重连，最终成 为成熟 mRNA 的一部分，称为 RI [5] 。
AS 的各种剪切方式并非独立发生，而是多种剪切 方式相互组合的，最终形成了不同的成熟 mRNA，不 同的成熟 mRNA 可能具有不同的功能，极大地丰富了 基因表达产物的多样性 [9] 。研究表明，高达 95% 的基 因存在 AS，可见 AS 在调控基因表达方面具有普遍性 和重要性 [10] 。
1.2 剪 切 体 在 前 体 mRNA 的 AS 所 必 需 的 RNA 剪 切和连接反应均发生在一种大型核糖核（Ribo Nucleo Protein，RNP）机器中，这种复杂的分子机器被称为剪 切体。剪切体可以在 AS 过程中精确识别剪切位点，并 且在催化剪切反应过程中发挥至关重要的作用 [11] 。因 此，剪切体是 AS 过程的关键因素。
剪切体由 5 个不同的小核核糖核蛋白颗粒（Small Nuclear Ribonucleo-Protein Particles，snRNP）和 100 多 种蛋白质共同组成 [12] 。snRNP 为剪切体的主要成分， 由蛋白质和核内小 RNA 组成。snRNP 共分为 7 种 U1~ U7， 其 中 U1、U2、U4、U5、U6 均 参 与 前 体 mRNA 的 AS。
剪切体在一个复杂而动态的循环中发挥作用，这个 循环包括剪切体的组装、反应和拆卸。snRNP 与其他 剪切因子有序的相互作用保证了剪切体的精确组装，在 组装过程中 5 个 snRNP 复合物（U1、U2、U4、U5 和 U6）精准识别并组装在每个内含子上，最终形成具有 催化活性的剪切体。剪切体的催化中心由 RNA 组成 [13] ， 因此，可以说剪切体是一种像核糖体一样的核酶。 1.3 RNA 结合蛋白 近年来，有证据表明 RNA 结合蛋 白（RNA Binding Protein，RBP） 与 AS 密 切 相 关， RBP 是细胞中一类重要的蛋白质，通过识别特殊的 RNA 结合域与 RNA 互作，广泛参与到 RNA 的剪切、 转运、序列编辑、胞内定位以及翻译控制等多个转录后 调控过程中 [7] 。
RBP 中的丝氨酸 / 精氨酸丰富蛋白（Serine/argininerich Protein，SR）家族和异质核糖核蛋白（Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein，hnRNP）家族均对 AS 具有 非常关键的差异调控作用。目前，控制 AS 的全套蛋白 质尚不明确 [1] ，普遍观点是 SR 蛋白促进 AS，hnRNPs 抑制 AS。但近期一些突破性的研究表明，SR 蛋白和 hnRNP 在剪切调控过程中均表现出双重作用，它们会 根据环境有选择地促进或抑制 AS 的发生，当 SR 蛋白 与其他剪切体组成部分结合时通常会促进 AS[14] 。顺式 元件是 RBP 的结合位点，hnRNP 和 SR 蛋白会作为反 式剪切因子结合内含子和外显子中的顺式元件，通过促 进和抑制的相互作用来调控剪切位点，这一机制在 AS 中发挥着关键作用 [15] 。
2 AS 在猪育种中的相关研究
在生猪养殖业中，猪的生产性状直接影响养猪企业 的经济效益 [16] 。高效益的猪种繁殖和选育可以改良猪 种性状、降低生产成本，从而提高养殖效益和企业竞争 力。AS 对猪性状相关基因的表达有着重要的调控作用， 显著影响猪的性状改良与品种选育。因此，研究 AS 的 作用机制对生猪养殖业的发展具有至关重要的意义。
2.1 繁殖性状 猪繁殖性状的优劣直接影响着企业的经 济效益，对畜牧业的高速发展有着重大意义 [17] 。
AS 对 猪繁殖性状有重要调控作用。 AS 存在显著差异并且 AS 水平较高的基因被称为 差异选择性剪切基因（Differential Alternative SplicingGenes，DASGs）[18] 。有证据表明，猪的 DASGs 对猪 繁殖性状有着重要影响 [19] 。例如，DASGs 显著富集于 昼夜节律、生物合成和信号传导等信号通路中，此外， 对猪性成熟具有调控作用的 DASGs 富集于催产素信号 通路、甲状腺激素信号通路、GnRH 信号通路和卵母细 胞减数分裂信号通路，这些通路可以在基因和 AS 水平 上调节雌性动物的繁殖功能 [19] 。
并且，涉及性腺发育、 激素代谢、昼夜节律的基因受到 AS 的差异调控 [19] 。 精子发生对动物繁殖性状有着重要影响，精子发生 的相关研究，证明了睾丸中基因的 AS 水平比其他组织 更高，并且雄性不育与 AS 显著相关 [20] 。因此，AS 或 将成为雄性不育治疗中的新方向。在猪精子发生过程中， 水通道蛋白 8（Aquaporin 8，AQP8）参与精子发生过 程中的细胞质凝结和液体形成，AQP8 基因通过 AS 产 生了 3 种剪切亚型，这些亚型在精子发生过程中扮演着 关键角色，对维持精子正常的生理功能和生殖健康具有 至关重要的作用 [21] 。由于剪切过程中去除的碱基数量 不是 3 的整数倍，AQP8 的氨基酸序列和蛋白质结构在 经历 AS 后发生了显著变化，从而显著影响猪精子的生 理功能和繁殖能力 [22] 。
前人研究表明，整个下丘脑 - 垂体 - 卵巢轴（HPO） 负责调控雌性动物的性成熟发生时间，进而调控动物 的性成熟时间和繁殖性能 [23] 。HPO 上的 DASGs 在内 吞信号通路、MAPK 信号通路和 Rap1 信号通路中显 著富集，这些通路和猪繁殖性状密切相关，并且基因 TAC1、TACR3、CYP19A1、ESR1、ESRRA 和 FSHR 的 AS 在性成熟期早期调节部分 HPO 组织的功能 [24] 。
睾酮对提高雄性生育能力有着重要影响，睾酮的合 成过程受到 AS 的调控 [25] 。例如，羟基类固醇 17-β 脱氢 酶 3（Hydroxysteroid 17-beta Dehydrogenase3，Hsd17b3）和 类固醇生成急性调节蛋白（Steroidogenic Acute Regulatory Protein，StAR） 主 要 在 哺 乳 动 物 睾 丸 的 间 质 细 胞 （Interstitial Cell，LC）中表达，可以促进睾酮合成、 提高雄性生育能力 [26] 。Hsd17b3 基因通过 AS 产生了 2 种蛋白质亚型，2 种亚型均在猪睾丸中高表达，对调控 猪繁殖性状有着重要作用 [27] 。在猪中发现了 StAR 的 3 种 AS 亚 型：StAR-a、StAR-b 和 StAR-c，StAR-a 是 StAR 基因转录后的主要 AS 亚型，可以促进胆固醇和 StAR的结合和转运，并且与雄性的睾丸形态密切相关[28] 。 2.2 脂 肪 沉 积 能 力 猪 的 脂 肪 沉 积 能 力 是 肌 内 脂 肪 （Intramuscular Fat，IMF） 发 育 的 决 定 性 因 素，IMF 存在于肌外膜、肌内膜和肌束膜这些膜之间以及肌纤维 间隙中，对改善肉品质有重要作用 [29] 。AS 作为基因表 达的转录后调控，对脂肪沉积具有显著影响。
有证据表明，差异表达的差异 AS 基因（Differential Expression-differential Alternative Splicing of Genes， DE-DASG）能够显著促进猪 IMF 沉积 [30] 。关于东方猪 种（肥肉型）和西方猪种（瘦肉型）的 AS 研究显示， 猪血液和脂肪组织中显著富集大量的 DASG[31] 。脂肪中 的 DE-DASG 富集于与脂肪沉积和免疫炎症相关途径， 而血液中的 DE-DASG 富集于与免疫炎症和代谢相关的 途径，例如脂肪组织中的 NSRP1 蛋白和 CCDC18 基因 对猪脂肪沉积有着潜在调节作用，NSRP1 蛋白通过调 节 AS 和 CCDC18 基因的表达来促进脂肪形成 [31] 。杜 洛克猪（瘦肉型）和陆川猪（肥肉型）的研究表明， 心脏和骨骼肌中的 DE-DASG 数量最多，此外，AS 事 件较多的基因与组织特异性功能密切相关，例如胰高 血糖素信号通路中的 3 个基因（PYGM、MAPK11 和 CAMK2B）在 2 个猪种中发生的不同 AS 差异高度显著 [32] 。
脂肪沉积相关基因通过 AS 产生的亚型对猪脂肪沉 积有着重要影响，例如比较基因识别 -58（Comparative Gene Identification-58，CGI-58）在多酶介导的脂解过 程中起着重要作用 [33] ，脂解过程影响着猪脂肪的分解 代谢，Li 等 [34] 发现猪 CGI-58 的 AS 亚型对脂解过程有 着关键调控作用；磷酸腺苷反应元件结合蛋白（Cyclic Adenosine Monophosphate Responsive Element Binding Protein，CREB）是一种碱性亮氨酸拉链转录因子，在 调控猪脂肪沉积过程中具有不可忽视的影响 [35] ，CREB 的 AS 亚型 V1 和 V2 都和猪的花生四烯酸代谢、PPAK 信号通路和 PI3K-Akt 信号通路等脂肪沉积通路相关， 间接影响着猪的脂肪沉积过程 [36] ；PELP1 基因的 2 个 AS 亚型与脂肪沉积或胰岛素抵抗显著相关，拷贝数变 异可能影响猪脂肪沉积，通过调控 PELP1 基因的 AS 影响猪 IMF 含量 [37] 。
2.3 肌肉发育 随着人们生活水平的提高，消费者开始寻 求更美味、更安全以及更有营养的猪肉，猪的肌肉品质 越来越受到重视，故改善猪肌肉品质是当代养猪业中的 重要任务 [38] 。研究发现多种 AS 基因的蛋白质亚型参与 猪骨骼肌发育和脂肪酸代谢，影响着猪的肌肉发育 [39] 。
唐琪等 [40] 证实了生长激素释放激素受体（GrowthHormone Releasing Hormone Receptor，GHRHR）对猪 的生长发育具有重要的调节作用。GHRHR 经过 AS 产 生了多种功能性 GHRHR 剪切亚型，这些亚型对猪肌肉 发育有重要影响 [41] 。
不同类型猪肌肉的品质各不相同，有证据表明， DE-DASG 影响着猪肌肉组织的生物学特性，例如在猪 胸最长肌与半腱肌中，DE-DASG 显著促进 2 种肌肉 之间的表型差异 [39] 。有研究表明，DASG 显著富集于 氧化肌和糖酵解肌差异发育过程，m6A 修饰通过调控 AS，显著促进氧化肌与糖酵解肌之间的表型差异化， 因此，AS 对不同类型肌肉的差异发育有重要影响 [42] 。 以上研究揭示了 AS 在不同类型猪肌肉发育过程中的关 键作用。
2.4 免疫能力 在生猪养殖业发展过程中，动物疾病严重 威胁着生猪健康，导致猪肉产品质量、产量下降甚至造 成猪的死亡，给生猪养殖业造成巨大的经济损失，阻碍 养猪业的快速发展。随着分子生物学和分子遗传学等科 学研究的进步，为得到免疫力高的猪种，AS 对猪免疫力 的影响逐渐受到人们的关注，并成为 AS 研究的热点 [43] 。
AS 通过差异调控免疫球蛋白 G（Immunoglobulin G，IgG）的 Fc 区受体（Fc-gamma Receptors，FcγR） 在猪免疫系统中扮演着至关重要的角色，FcγR 分为 FcγRI、FcγRII 和 FcγIII 3 种类型，它们调节着体液和 细胞介导的免疫反应，具有不同的 IgG 结合能力和吞噬 能力 [44] 。FcγRI 的剪切亚型可以差异调控猪蓝耳病病毒 （Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus， PRRSV）的抗体依赖性增强效应，因此，猪 FcγRI 通 过 AS 机制在 PRRSV 增殖和炎症过程中发挥双重调节 作用，这将成为 PRRSV 预防和控制的新靶点 [45] 。目前， 猪 FcγRII 至少存在 5 种 AS 亚型，这些亚型可以差异调 控猪免疫系统中 FcγRII 介导的免疫反应 [46] 。FcγIII 在 免疫细胞的抗体介导效应功能中起重要作用，猪 FcγIII 通过 AS 产生 3 种剪切亚型，3 种亚型在机体内差异调 控 FcγIII 介导的免疫反应 [47] 。
免疫相关基因或蛋白通过 AS 产生的亚型对猪免疫 能力有着重要影响。研究发现猪早幼粒细胞白血病蛋 白（Promyelocytic Leukemia，PML） 在 DNA 损 伤 修 复、细胞凋亡和抗病毒免疫反应等免疫过程起着关键 作用，猪在感染日本脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus，JEV）后，PML 剪切亚型的表达显著增加 [48] 。 PML 共有 5 种 AS 亚型，在 JEV 感染期间，亚型 PML1、 PML3、PML4 和 PML5 过表达会抑制 JEV 复制，增强 猪的免疫力 [49] 。TCF3 基因对淋巴细胞发育和上皮 - 间充 质转化有重要的作用，显著影响着猪的免疫系统功能 [50] ， TCF3 基因共有 4 种 AS 亚型，分别为 TCF（E12）、 TCF（E47）、TCF3A 和 TCF3B。TCF3A 和 TCF3B 在 淋巴细胞成熟过程中扮演关键角色，并与猪瘟病毒逃逸 机制密切相关 [51] 。有研究显示，在猪各种组织中发现 了糖原合酶激酶 -3（Glycogen Synthase Kinase-3β， GSK-3β）的 5 种 AS 亚型（GSK3β-1、GSK3β-2、GSK3β-3、 GSK3β-4、GSK3β-5），GSK-3β 是丝氨酸 / 苏氨酸激 酶，对猪免疫能力有重要影响，参与多种疾病和细胞过 程，例如情绪障碍、阿尔茨海默病、糖尿病和癌症等 [52] 。 GSK-3β 的不同剪切亚型在仔猪和成年猪的各种组织中 有不同的表达模式，并对糖原合酶表现出不同的活性， 与其他亚型相比，亚型 GSK3β-5 在调控猪部分基因的 糖原合酶活性、磷酸化和表达方面有特异性作用，并且 在胰岛素治疗过程中，不同的剪切亚型在胰岛素信号传 导通路中发挥不同功能 [53] 。
AS 对藏猪肺部发育有着差异调控作用，显著影响 藏猪的免疫系统，这一机制对于生长于青藏高原的藏猪 生长发育至关重要 [54] 。在缺氧条件下，DASGs 影响藏猪 抗原的加工、递呈和生物合成，并且 DASGs 显著富集 于趋化因子信号通路、B 细胞受体信号通路和细胞因子 - 细胞因子受体相互作用通路等通路中，这些通路在缺氧 条件下对肺部发挥着重要的免疫调节和炎症作用 [54] 。
在特定情况下，AS 会导致猪的免疫力降低 [55] 。例 如，猪感染 PRRSV 期间，LMO7、SLC25A27、ZNF185 和 ECM1 等 基 因 的 AS 和 m6A 修 饰 显 著 改 变， 基 因 LMO7 和 ZNF185 的 AS 水平提高、mRNA 表达水平降 低，这些变化可能会导致猪免疫力降低，促进病毒的入 侵和复制 [55] 。
3 小结与展望
AS 作为一种基因表达的调控机制，在动物发育和 生理功能中扮演着关键角色。在猪的繁殖性状、脂肪沉 积能力、肌肉发育和免疫能力等方面，AS 的差异调控 作用尤为显著。这种调控机制不仅影响着猪的生长效率 和肉质特性，还直接关系到其免疫能力。
当前，对猪的 AS 研究主要集中在探索 AS 如何影
响猪的繁殖性状和肌肉生长特性以及剪切亚型在脂肪形 成过程中的作用等方面，并且揭示了剪切亚型在免疫应 答中的功能。尽管相关研究已取得了一定进展，但仍 存在一些挑战和不足。例如，许多剪切亚型功能尚未 明确；剪切调控网络尚未完全解析。为了深入挖掘 AS 的调控机制与应用前景，未来的研究可以聚焦于研究剪 切亚型在细胞功能中的具体作用，解析 AS 的调控网络， 对潜在的剪切亚型标志物进行大规模的临床验证，探索 剪切亚型作为药物靶点的可能性。在推进 AS 研究的同 时，还需要考虑样本个体遗传背景和环境因素。
AS 的研究为猪的优良品种选育与免疫研究开辟了 新的途径和思路。深入理解剪切调控机制，可以在育 种过程中优化猪的品种选择，提高肉质，增强抗病能力， 从而为猪的遗传育种和肉质改良提供科学依据和技术 支持。
