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1.大肠杆菌噬菌体裂解酶的表达纯化及杀菌活性分析
作者：廉乐乐,袁橙,郝福星,汤芳,陆辉,薛峰,戴建君
作者单位：江苏农牧科技职业学院;南京农业大学
关键词：大肠杆菌;噬菌体;裂解酶;杀菌活性
摘 要：为分析本研究前期分离的大肠杆菌噬菌体Hab-EA株是否编码裂解酶（Lysin）基因，且该裂解酶蛋白是 否对大肠杆菌（E. coli）具有杀菌活性，本研究根据GenBank中大肠杆菌噬菌体lysin基因序列，采用Primer 5设计简并 引物，经PCR扩增Hab-EA株的假定裂解酶（称为lysEha1）基因并测序，分别采用ORF Finder和BLAST分析该基因的 ORF，采用SWISS模型预测该ORF编码Lysin蛋白的空间结构。对已确定的lysEha1 ORF序列设计表达引物。以简并 引物经 PCR 扩增的产物为模板，采用表达引物经 PCR 扩增 lysEha1 基因完整的 ORF，构建原核表达载体 pET-30a （+）-lyEha1-ORF，经PCR和测序鉴定正确后通过原核表达系统表达并经Ni亲和层析柱法纯化LysEha1 ORF（即重组 裂解酶蛋白rLysin），利用SDS-PAGE与western blot鉴定该蛋白的表达与纯化效果。简并引物的PCR结果显示，扩增 到约1 200 bp的目的条带，测序结果经ORF Finder分析显示：该片段的nt39~nt536存在一个498 bp的ORF；BLAST 分析显示，该ORF属于大肠杆菌噬菌体Lysin家族基因。Lysin蛋白的二级结构含7段α螺旋，3段β折叠。表达引物 的PCR结果显示在约500 bp处出现目的片段，测序结果显示该 ORF为噬菌体lysin基因。SDS-PAGE和western blot结 果均显示，在约25 ku处出现特异性目的条带，且rLysin主要在上清中表达，纯化后可见单一目的条带。采用浊度递 减试验测定rLysin及其与EDTA联用（rLysin+EDTA）后分别对16株E. coli的杀菌活性。结果显示，rLysin对16株致病 性大肠杆菌的总杀菌率为56.25%（9/16），rLysin+EDTA对上述细菌的总杀菌率达87.5%（14/16），rLysin+EDTA的杀菌 率显著高于rLysin（P）。上述结果表明，噬菌体Hab-EA株可编码Lysin，本研究正确表达并纯化了该rLysin，并 证实其对致病性大肠杆菌的杀菌活性较强，与EDTA联用可以提高rLysin对致病性大肠杆菌的杀菌活性。本研究为 致病性大肠杆菌病的防控提供新的思路与途径。
致病性大肠杆菌属于革兰阴性菌，广泛存在于 外界环境中，主要引起家禽和家畜的急性或慢性感 染，临床上常引起原发性感染或者继发感染其他疾 病。致病性大肠杆菌存在多种血清型，且优势血清 型具有区域差异性，另外其耐药菌株的不断产生[1] ， 这些因素给致病性大肠杆菌所致疾病的防控带来了 困难。近年来，抗生素的严格限制使替抗产品的研 发对致病性大肠杆菌感染的防控以及人类健康愈发 重要。已发现噬菌体对大肠杆菌有致死效果[2] ，具有 因此作为替抗产品的潜力逐渐受到重视。
噬菌体侵染细菌后会在宿主菌内增殖，破坏其 细胞膜和细胞壁，从而裂解宿主菌，释放子代噬菌 体[3] 。因此，研究者不断开展与噬菌体裂解功能的相 关研究。参与子代噬菌体释放过程的相关蛋白可能 是潜在的新型抗菌制剂，尤其是裂解酶（Lysin）[4] 。 Lysin 是噬菌体复制末期合成的一类蛋白质，能够降 解细胞壁释放子代噬菌体，是噬菌体裂解细菌的关 键酶[5] 。Lysin作为一种新型抗菌剂，和传统的抗生素 相比，具有作用迅速、可特异性作用于宿主菌而不 损害正常微生物菌群及不易产生耐药性等优点[6- 7] 。 且Lysin可以与其他抗菌剂协同作用[8] ，对治疗细菌类 疾病更有效。目前革兰阳性菌 Lysin 作为防治细菌非 常有效的替抗产品，已经进入临床实验阶段[9] 。而革 兰阴性菌噬菌体 Lysin 的相关研究较少，为了充分挖 掘革兰阴性菌噬菌体 Lysin 在对抗多重耐药菌株中的 作用潜力，研究者们大多关注如何使裂解酶破坏细菌 细胞壁的外膜层（Outer membrane，OM）屏障以更好靶 向革兰阴性细菌肽聚糖层（Peptidoglycan，PG），以达 到更好裂解菌体的效果[10] 。为了探究噬菌体 Lysin 对 革兰阴性菌致病性大肠杆菌的抑菌效果，本研究通 过对本实验室前期制备的大肠杆菌噬菌体 lysin 基因 经原核表达和纯化，并采用浊度递减法检测其对致 病性大肠杆菌的杀菌活性，为致病性大肠杆菌病的 防治提供新思路。
1 材料与方法
1.1 主要实验材料 大肠杆菌噬菌体 Hab-EA 株、 大肠杆菌（E. coli）K12 标准株，E. coli ATCC83903、ATCC83529、ATCC83915 株、5 株猪场分离的 E. coli （E. coli O142、E. coli DN69-A、E. coli DN89-B、E. coli DN1502、E. coli O157：H7）、7 株多重耐药禽致病性 大肠杆菌（APEC）不同血清型[E. coli 1（O55）、E. coli 2 （O18）、E. coli 3（O64）、E. coli 4（O142）、自凝E. coli 5； E. coli 6（O9）及自凝 E. coli 7]均由本实验室分离并保 存。高纯质粒小量提取试剂盒和多功能 DNA 纯化回 收 试 剂 盒 购 自 Bioteke 公 司 ； DL2000 DNA Marker、 DL2000 plus II DNA Marker、Page Ruler Prestained Protein Marker、rTaq DNA聚合酶、BamH I、Xho I和T4 DNA 连 接酶等试剂均购自 TaKaRa 公司；小鼠源 His 标签单 克隆抗体（MAb）购自百奥莱博生物科技有限公司； HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG（IgG-HRP）购自上海碧云 天生物科技有限公司；EDTA购自Biotopped公司。
1.2 引物的设计与合成 根据GenBank 中15株大肠 杆菌噬菌体 lysin 基因序列（由于菌株数量多，基因 登录号就不在此展示），采用 Primer 5 软件设计简并 引物：Primer1：GATCGGGYTMGTTATGAGTRAACTG （下划线为 3 个简并位点）/Primer2：CAATACCACG TCCGTGTGGTTATGTC。根据已分析确定的 lysEha1 ORF 序列采用 Primer 5 软件设计表达引物：上游引 物：GCGCGGATCCATGAAACTTGATAAAAATG，下 划线为 BamH I 酶切位点/下游引物：CCGCTCGAGT TAATCCAGAACAACA，下划线为Xho I酶切位点。上 述引物均由华大生物科技有限公司合成。
1.3 噬菌体假定裂解酶（称为 LysEha1）基因的 PCR 扩增及其空间结构的预测 提取噬菌体 Hab-EA 株 基因组 DNA 作为模板，利用简并引物 Primer1/2 经 PCR 扩增 lysEha1 基因，纯化回收后测序。测序后采 用 ORF Finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/） 分析该基因完整的开放阅读框（ORF）；采用 BLAST （https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）分 析 该 ORF 及 其属性。以纯化回收的 lysEha1 基因作为模板，利用 表达引物 Primer3/4 经 PCR 扩增 lysEha1 基因完整的 ORF（lysEha1 ORF）并测序。根据测序序列采用 DNA⁃ MAN 推导成氨基酸序列，采用 SWISS 模型（https:// swissmodel.expasy.org/）预测裂解酶的空间结构。
1.4 重组表达质粒的构建与 LysEha1 ORF（重组裂 解酶蛋白，rLysin）表达与纯化的鉴定 将 pET-30a （+）质粒和 1.3 经表达引物扩增的 PCR 产物分别采用 BamH I 和 Xho I 双酶切，利用 T4 DNA 连接酶连接构 建重组质粒 pET-30a（+）-lysEha1-ORF 并经 PCR 和测 序鉴定。将鉴定正确的 pET-30a（+）-lysin 及空质粒 pET-30a（+）分别转化E. coli Rosetta（DE3）获得重组表 达菌株及对照菌株。上述菌株分别于 37 ℃ 培养至对 数生长期后加入终浓度为 0.5 mmol/L 的 IPTG，16 ℃ 220 r/min 诱导 20 h 后离心收集菌体，超声破碎后 离心分别收集上清和沉淀，经 SDS- PAGE 电泳检 测 LysEha1-ORF（重组 Lysin，rLysin）的表达以及表达 形式。参考上述方法扩大诱导体系，收集菌体超声 破碎并离心后取上清，采用 Ni 亲和层析柱法纯化 rLysin，采用 SDS-PAGE 检测纯化效果。以鼠源 His MAb（1:8 000）为一抗，以 IgG-HRP（1:5 000）为二 抗，经western blot 进一步鉴定rLysin 的纯化效果。采 用 BCA 蛋白定量试剂盒测定纯化后 rLysin 的浓度。
1.5 rLysin 的体外杀菌活性检测 采用浊度递减 试验[11] 测定 rLysin 对 16 株 E. coli 的杀菌活性。具体 方式如下：第1组（rLysin 组）：在96孔板中分别加入 25 μL（2.2 mg/mL）rLysin、25 μL PBS（1 mol/L），第 2 组（rLysin+EDTA）：分别加入 25 μL rLysin（2.2 mg/mL）、 25 μL EDTA（2 mmol/L），第3组为EDTA对照组：分别 加入25 μL EDTA（2 mmol/L）、25 μL PBS（1 mol/L）。第 4 组为 PBS 对照组：分别加入 50 μL PBS（1 mol/L）。 每组各孔均加入50 μL长至对数生长期的致病性大肠 杆菌（108 cfu/mL）。上述各组均于 37 ℃作用 20 h 后测 定 OD600nm值作为Ni，各组于37 ℃作用前测定的OD600nm 值为 N0，Ni0表明具有杀菌活性，杀菌率=1- Ni/N0。 每组试验均重复3次。采用t检验分析rLysin与rLysin+ EDTA杀菌活性的差异性，*：P表示差异显著。
2 结果与讨论
2.1 噬菌体 lysin 基因的 PCR 扩增及其空间结构的 预测结果 以噬菌体 Hab-EA 株基因组 DNA 作为模 板，利用简并引物 Primer1/2 经 PCR 扩增其 lysEha1 基 因，结果显示，在约1 200 bp处出现目的片段（图1A）。 测序结果经 ORF Finder 分析显示，在扩增的 1 200 bp 片段的nt39~nt536存在一个498 bp的ORF；经BLAST 分析结果显示，该 ORF 属于大肠杆菌噬菌体裂解酶 家族基因。以上述 PCR 产物为模板，采用表达引物 经 PCR 扩增 lysEha1 基因完整的 ORF，结果显示，在 约 500 bp 处出现目的片段（图 1A）。测序结果显示该 ORF 确实为大肠杆菌噬菌体 lysin 基因，采用 DNA⁃ MAN 翻译后该 lysin 基因共编码 166 个氨基酸。表明 噬菌体Hab-EA 株确实含lysin基因。
噬菌体属于一种在自然环境中大量存在且能感 染细菌等其他微生物的病毒，最早由 Twort 和 D'Her⁃ elle分别于1915年和1917年发现[12] 。鉴于本实验室保 存的噬菌体Hab-EA株为烈性双链DNA噬菌体，推测 其具备编码 Lysin 的潜力。设计简并引物是扩增未知 基因的一种方式[13-14] ，本研究通过分析 GenBank 中大 肠杆菌噬菌体 lysin 基因序列特点设计简并引物，采 用该引物经 PCR 扩增后采用 ORF Finder 和 BLAST 分 析发现该 PCR 产物含 Lysin 基因并被正确扩增，表明 噬菌体Hab-EA株确实编码Lysin。并采用SWISS模型 （https://swissmodel.expasy.org/）预测该 Lysin 的空间结 构。结果显示该蛋白具有有序的空间结构，其 二级结 构包含7段α螺旋，3段β折叠（图1B-a）；N端为疏水 区，C端为亲水区（图1B-b），相关研究表明C末端疏 水性氨基酸有助于 Lysin 穿透革兰阴性菌细胞外膜从 外部裂解大肠杆菌[15] ；另外推测 Lysin 的三级结构有 可能以三聚体的形式存在，但其具体结构还需进一 步探究。
2.2 重组表达质粒的构建与 rLysin 表达、纯化的鉴 定结果 将经 PCR 扩增的 lysEha1 基因 ORF 克隆至 pET-30a（+）中构建重组质粒，经PCR鉴定结果显示， 扩增到约 500 bp 的目的条带（图 2A），与预期结果一 致；测序结果显示插入基因序列完全正确，表明正确构 建重组质粒pET-30a（+）-lysEha1-ORF。利用大肠杆菌 原核表达系统表达lysEha1 ORF（即为rLysin）并经SDSPAGE检测，结果显示，重组菌pET-30a（+）-lysEha1- ORF/Rosetta（DE3）经 IPTG 诱导后出现约 25 ku 的目的 条带，且主要在上清中表达，而经IPTG诱导的阴性对 照菌液则无该目的条带（图2B）；经Ni亲和层析柱纯化 后可见约25 ku的单一目的条带（图2B），经BCA试剂 盒检测rLysin的浓度为2.2 mg/mL。经western blot进一 步鉴定rLysin的纯化效果。结果显示在25 ku处出现单 一特异性条带（图2C）。表明rLysin在大肠杆菌中获得了 表达，且纯化效果及反应原性均较好。在体外表达噬菌 体Lysin时，有些Lysin会对表达菌株产生毒性，并且其 分子量较大、疏水性强[12] ，导致蛋白常以包涵体的形式 表达。而本研究通过大肠杆菌原核系统表达的噬菌体 rLysin为可溶性蛋白，对于后期检测该蛋白的杀菌活性 奠定了良好基础。部分革兰阴性菌噬菌体 Lysin 为小 的单结构域的球状蛋白（分子量在 15 ku~20 ku）[16-17] ， 本研究表达的Lysin蛋白为25 ku左右。表明经原核表 达的rLysin确实为大肠杆菌噬菌体Lysin蛋白。
2.3 rLysin 对致病性大肠杆菌体外杀菌活性的检测 结果 采用浊度递减试验测定rLysin 对16种E. coli 的 杀菌活性，结果显示：rLysin 对 E. coli ATCC83529、 E. coli O157:H7 和 7 株多重耐 APEC 的杀菌率均高于 20%；其中rLysin对E. coli ATCC83529、E. coli O157:H7 及 3 株 APEC 的杀菌率均高于 50%；且其总杀菌率达 56.25%（9/16）；rLysin+EDTA 对 3 株 E. coli 标准菌株、 4 株猪场分离的 E. coli 及5株APEC 的杀菌率在20%~ 60%，其对E. coli K12、E. coli 1和E. coli 4的杀菌率均 高于 50%且提高了其对 E. coli 1（从 29.17%提高至 41.2%）、E. coli 4（从45.2%提高至52.2%）和E. coli 7的 杀菌率（从17.44%提高至27.5%）；并且使rLysin的杀菌 率从56.25%提高至87.5%，总杀菌率达87.5%（14/16）。 EDTA和PBS对照组杀菌率均为0（图3A）。采用t检验 统计学分析比较rLysin与rLysin+EDTA的杀菌活性，结 果显示，rLysin+EDTA的杀菌率显著高于rLysin（图3B） （P）。表明 rLysin 具有较强的杀菌能力，且与 EDTA联用后杀菌效果更好和杀菌谱更广。
大多数革兰阳性菌噬菌体Lysin存在双结构域，主 要由催化结构域和结合结构域组成[18] 。相比之下，大多 数革兰阴性菌噬菌体 Lysin 只有催化结构域而无结合 结构域[19] ，无法将 Lysin 特异性锚定于菌体肽聚糖； EDTA 作为外膜渗透剂能够协助外源 Lysin 渗透到达 细菌细胞壁肽聚糖层，提高 Lysin 对细菌体外的裂解 活性[20] 。因此本研究分别采用rLysin 及rLysin 与EDTA 联用分析二者对 16 株致病性大肠杆菌的体外杀菌效 果。结果显示，单独使用rLysin及与EDTA联用均具有 较好的杀菌活性，对养猪场临床分离的E. coli和多重 耐药性致病性大肠杆菌均有杀菌效果；但 rLysin 与 EDTA联用对养猪场临床分离E. coli 的杀菌率不高，推 测原因可能是噬菌体Lysin对细菌的裂解活性与温度、 酸碱度及其空间结构的完整性等均有关[21-22] ，后续将 进一步开展相关研究以提高噬菌体Lysin 的杀菌活性。 另外rLysin+EDTA对E. coli ATCC83529株和E. coli 5的 杀菌率下降，甚至对 E. coli 2 和 E. coli 3 无杀菌活性， 推测可能与EDTA的浓度有关[18] 。
本研究在未对大肠杆菌噬菌体基因组测序的情 况下，根据 GenBank 登录的大肠杆菌噬菌体 lysin 基 因序列设计简并引物后经 PCR 扩增大肠杆菌噬菌体 lysEha1 基因，采用软件分析该 PCR 产物可能含 lysin 基因，采用表达引物扩增到大肠杆菌噬菌体 lysEha1 基因的 ORF。利用原核表达系统表达并纯化 lysEha1 基因的ORF，证实该ORF表达的rLysin在体外具有较 广杀菌谱，且对多重耐药APEC 具有杀菌活性。本研 究为革兰阴性噬菌体 Lysin 用于防控致病性大肠杆菌 病提供参考依据。
