重庆医科大学学报杂志已发表格式范文参考
1.百里香酚通过SCIN改善自闭症核心症状的作用研究
作者：王楚萱,余丽娟,吕明其,李英博
作者单位：重庆医科大学
关键词：自闭症谱系障碍;丙戊酸;百里香酚;肌切蛋白
【摘 要】目的：通过构建丙戊酸（valproic acid，VPA）诱导的自闭症（autism spectrum disorder，ASD）大鼠模型并进行百里香酚 （thymol，Thy）的干预，探讨Thy通过肌切蛋白（scinderin，SCIN）改善ASD大鼠核心症状的作用。方法：通过三箱社交实验、旷场 实验以及青年社交实验观察大鼠的ASD 样行为；RNA-seq实验检测大鼠前额叶皮层（prefrontal cortex，PFC）中RNA表达情况； Western blot实验检测大鼠PFC中SCIN蛋白水平。结果：与对照组大鼠相比，模型组大鼠表现出了ASD样行为，包括社交能力 下降、社交偏好受损、探索能力下降、重复刻板行为［与对照组大鼠相比，模型组大鼠站立次数减少（P）；自我梳理时间增 加，（P=0.003）］等，且PFC中SCIN表达水平升高；通过对模型组大鼠进行Thy治疗后，其ASD 样行为明显改善［（与模型组大鼠 相比，干预组大鼠站立次数增加（P）；自我梳理时间减少（P=0.004）］，且 SCIN 表达基本恢复到了正常水平。结论：ASD 模型大鼠 PFC 中 SCIN 的异常表达可能会导致大鼠的 ASD 样行为，Thy 干预后可以降低 SCIN 的表达水平从而改善 ASD 核心 症状 .
近年来，自闭症谱系障碍（autism spectrum dis⁃ order，ASD）越来越受到社会广泛的关注。ASD的病 因复杂，病程长，治疗手段多样化，如果预后不理 想，甚至会有终生障碍，给患病家庭及社会带来沉 重负担[1] 。研究发现，ASD 受遗传和环境多种因素 共同影响，也是多基因突变导致的复杂疾病[2-3] 。其 中环境因素里最常见的是孕产期生化及免疫因素， 例如孕期母体使用抗癫痫药物丙戊酸（valproic acid，VPA），其后代患ASD的风险明显增加[4] 。已有 文献证实，百里香酚（thymol，Thy）可调节 VPA 诱导 的 ASD 大鼠的炎症反应，改善 ASD 大鼠的核心症 状[5] 。因此，首先对正常组大鼠、VPA诱导的ASD模 型大鼠以及 VPA+Thy 干预组大鼠进行了 RNA-seq 检测，结果发现与对照组大鼠相比，VPA 诱导的ASD模型大鼠前额叶皮层（prefrontal cortex，PFC）中 的肌切蛋白（scinderin，SCIN）表达明显升高，给予 Thy干预后SCIN表达明显下调，提示SCIN可能参与 Thy 改善 ASD 核心症状过程。SCIN 是一种钙依赖 性的肌动蛋白[6] ，主要参与细胞骨架的重组和细胞 分泌过程[7] ，可能在神经元发育、突触功能和细胞骨 架动态中发挥作用。相关文献证明，SCIN 基因 SNPs 位点的变化在多发性硬化症发病中起着主要 的作用[8] 。多发性硬化症是一种中枢神经系统慢性 炎症脱髓鞘性疾病，神经髓鞘受到破坏会影响到神 经轴突的信号传导，从而失去大脑和脊髓对外周的 控制，以至于丧失多部位功能[8] 。但目前并没有 SCIN 与 ASD 的相关报道。本实验将在前期工作基 础上，初步探究Thy通过SCIN改善ASD核心症状的 作用，期望能为ASD的干预和治疗提供新的理论依 据和思路。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 SD大鼠从重庆医科大学实验动物中心采 购 Sprague-Dawley（SD）大鼠共 30 只（雌雄比 2∶1），饲养于 23~25 ℃，相对湿度 50%~60%条件下，自由进食和饮水。本 研究得到重庆医科大学实验动物中心实验动物伦理委员会 的审查批准（批准号：IACUC-CQMU-2024-0953）。
1.1.2 主要试剂 Western blot 专用二抗（碧云天生物技术 有限公司，中国）；Western blot化学发光HRP底物（Millipore， 美国）；5%牛血清白蛋白（武汉博士德生物工程有限公司，中 国），BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术有限公司， 中国）；PMSF 蛋白酶抑制剂（碧云天生物技术有限公司，中 国）；PAGE凝胶快速制备试剂盒（上海雅酶生物医药科技有 限公司，中国）；PVDF 膜（Millipore，美国）；RIPA 裂解液（碧 云天生物技术有限公司，中国）；WB 一抗稀释液（碧云天生 物技术有限公司，中国）；VPA（Sigma，美国）；Thy（福建中农 牧生物药业有限公司，中国）；抗SCIN（杭州华安生物技术有 限公司，中国，HA722465，1∶1 000）；抗 β-actin（武汉三鹰生 物技术有限公司，66009-1-Ig，1∶5 000）。
1.2 实验方法
1.2.1 VPA 诱导的 ASD 大鼠模型建立 将成年 SD 大鼠饲 养两周适应环境后，按照雌雄比例 1∶1于每晚 18：00点进行 合笼。如果次日早上有阴栓脱落则表明受孕成功，当天标记 为受孕第 1天。将受孕的雌鼠分为 2组，1组按照 600 mg/kg 的剂量在大鼠妊娠第 12.5 天时腹腔注射 VPA 溶液，产下的 雄性崽鼠经过行为学鉴定即为VPA模型鼠[5] ；另一组大鼠在 受孕第12.5天腹腔注射等体积生理盐水，产下的雄性崽鼠即 为正常对照鼠[5] 。
1.2.2 Thy 干预 从 VPA 大鼠出生后第 28 天开始，将 Thy （300 mg/mL溶于羧甲基纤维素）按照30 mg/kg的剂量灌胃给 药[9] ，1 次/d，连续 7 d。将大鼠分为 3 组：对照组、模型组、干 预组。
1.2.3 行为学检测
1.2.3.1 三箱社交实验 该测试在受试大鼠出生第 35天进 行。三箱社交实验检测SD大鼠的社交行为和它们对新事物 的偏好[10] 。将1个矩形透明亚克力箱（120 cm×45 cm×40 cm） 分成 3个大小一致的腔室（A箱、B箱、C箱）。本实验一共包 括了3个阶段，①适应阶段：提前1 d将受试大鼠送到行为学 实验室以适应测试环境，在 A、C箱中放入相同的铁笼，分别 记为 circle a 和 circle b。将受试大鼠从 B 箱放入，让受试大 鼠在箱子中自由活动 10 min。②第一阶段（0~10 min）：在 circle a内放入1只与受试大鼠陌生且同龄的雄性大鼠（陌生 鼠1），circle b内不放东西（空笼子）。受试大鼠从B箱放入， 由 Smart 软件监测受试大鼠活动情况。③第二阶段（10~ 20 min）：暂取出受试大鼠，在circle b内放入1只新的与受试 大鼠陌生且同龄的雄性大鼠（陌生鼠 2），circle a 不变（陌生 鼠 1）。再将受试大鼠放入B箱，继续由Smart软件监测受试 大鼠活动情况。
1.2.3.2 旷场实验 该测试在大鼠出生第 37天进行。本实 验采用开放式不透明亚克力箱（100.0 cm×100.0 cm×46.7 cm） 记录动物的运动活动和探索情况。使用 Smart 行为学检测 软件将箱子底面划分为25个均一的正方形格子，取中间9个 格子作为中间格，外面 16 个格子作为外周格。在试验开始 前 1 d，每只受试大鼠给予 10 min 时间进入箱子熟悉环境。 试验开始后计时10 min，其间受试大鼠可自由探索。记录受 试大鼠捋毛时间[11 （] 重复刻板行为）以及站立次数（探索 能力）。
1.2.3.3 青年社交实验 该测试在受试大鼠出生第 39天进 行。将受试大鼠置于方形亚克力箱（50 cm×50 cm×50 cm） 中，箱内铺有 5 cm 厚的干净垫料。将受试大鼠和陌生大鼠 （与被受试大鼠不同笼、不同年龄，同性别）放入箱子中 10 min。在测试过程中，由 Smart 行为学软件对受试大鼠进 行录像，并手动记录受试大鼠的互动时间（嗅、舔、触、跟随）、 主动追逐陌生大鼠的时间和挖掘垫料的时间[12] 。
1.2.4 RNA-seq 实验 本实验是由苏州帕诺米克生物医药 科技有限公司检测（项目编号：HT202210310600019）。用寡 核苷酸（dT）磁珠富集总RNA中具有polyA结构的mRNA，然 后用离子中断法将RNA分割成约300 bp长的片段。以RNA 为模板用 6碱基随机引物和反转录酶合成 cDNA 第一链，并 以第一链cDNA为模板进行第二链cDNA的合成。文库构建 完成后，利用PCR扩增富集文库片段，进而根据片段的大小 （300~400 bp）进行文库筛选。然后用 Agilent 2100生物分析 仪检测文库大小，荧光定量检测文库总浓度。选择最佳的上 样量上机，以单链文库为模板进行桥式 pcr 扩增、测序引物 退火、边合成边测序。
1.2.5 Western blot 实验 大鼠腹腔注射 30 mg/kg 戊巴比妥 钠溶液麻醉。灌注生理盐水直至肝脏变白，血液变清。快速 剥离脑组织取出PFC，并在含有苯磺酰氟（phenylmethanesul⁃ fonyl fluoride，PMSF，1 mmol/mL）的蛋白裂解液中均质化。 在 4 ℃下以 12 000 r/min 离心 15 min 后收集上清液并在 -80 ℃下储存。将蛋白质添加到变性的 10% 或 12% SDSPAGE 凝胶中，并转移到 PVDF 膜上。将膜在室温下与 5% 脱脂牛奶一起孵育2 h。然后将PVDF膜与一抗孵育12~15 h。 次日，将膜与酶标记的二抗在室温下孵育 1 h。使用 Image J 对条带进行定量分析。
1.3 统计学方法
以上所有实验结果均为平均值。采用 GraphPad Prism8.0进行数据统计分析，符合正态分布和方差齐性的计量资 料以均数±标准差（x±s）表示，使用单因素方差分析，并以 Tukey多重比较检验作为组间两两比较。对于不符合正态分 布的计量资料用中位数（四分位间距）[M（d P25，P75 ）]表示，采 用Kruskal-Wallis非参数检验，并以Dunn’s多重比较检验作 为组间两两比较。检验水准α=0.05。
2 结 果
2.1 Thy可改善VPA诱导的ASD大鼠ASD样行为
2.1.1 Thy 可以改善 VPA 大鼠社交能力下降，社交偏好受 损 第一阶段（0~10 min）的测试中（表 1、图 1A）：与对照组 大鼠相比，模型组大鼠与陌生鼠 1 交流的时间较少（事后分 析，P=0.001）；与空笼子接触的时间较多（事后分析，P= 0.003）；在A箱中待的时间较少（事后分析，P=0.040）；在C箱 中待的时间较长（事后分析，P=0.032）；在B箱中待的时间差 异无统计学意义（事后分析，P=0.978）。与模型组大鼠相比， 干预组大鼠与陌生鼠 1 交流的时间较多（事后分析，P= 0.032）；与空笼子接触的时间较少（事后分析，P=0.022）；在 A 箱中待的时间较多（事后分析，P=0.040）；在C箱中待的时 间较少（事后分析，P=0.001）；在B箱中待的时间差异无统计 学意义（事后分析，P=0.299）。第二阶段（10~20 min）的测试 中（表 2、图 1B）：与对照组大鼠相比，模型组大鼠与陌生鼠 1 交流的时间较多（事后分析，P=0.028）；与陌生鼠2接触的时 间较少（事后分析，P=0.004）；在 A 箱中待的时间较多（事后 分析，P=0.004）；在 C 箱中待的时间较少（事后分析，P< 0.001）；在 B 箱中待的时间差异无统计意义（事后分析，P= 0.842）。与模型组大鼠相比，干预组大鼠与陌生鼠 1交流的 时间较少（事后分析，P=0.040）；与陌生鼠2接触的时间较多 （事后分析，P=0.028）；在 A 箱中待的时间较少（事后分析， P=0.009）；在C箱中待的时间较长（事后分析，P=0.001）；在B 箱中待的时间差异无统计学意义（事后分析，P=0.821）。说明 与对照组大鼠相比，模型组大鼠社交能力下降、社交偏好受 损，给予Thy干预后，大鼠社交能力和社交偏好均得到改善。
2.1.2 Thy可以改善VPA大鼠探索能力下降，重复刻板行为 增加 与对照组大鼠相比，模型组大鼠站立次数减少[图 2A：F（2，18）=13.350，P；事后分析，P，自我梳理时 间增加[图 2B：对照组=46.000（31.000，72.000），模型组= 109.000（106.000，137.000），Kruskal-Wallis 检验=13.410，P= 0.001；事后分析，P=0.003]。与模型组大鼠相比，干预组大鼠 站立次数增加[图 2A：F（2，18）=13.350，P；事后分析，P< 0.001 for]，自 我 梳 理 时 间 减 少 [ 图 2B：模 型 组 =109.000 （106.000，137.000），干预组=47.000（36.000，58.000），KruskalWallis检验=13.410，P=0.001；事后分析，P=0.004]。说明 Thy 干预后模型组大鼠 ASD 样焦虑情绪得到缓解，探索能力提 高，重复刻板行为减少。
2.1.3 Thy可以改善VPA大鼠自主交流、探索能力下降 与 对照组相比，模型组大鼠社交时间[图 3：对照组=107.000 （95.000，113.000），模型组=51.000（39.000，64.000），KruskalWallis 检验=13.590，P=0.001；事后分析，P=0.007]、主动追逐 时间[图 3：F（2,18）=36.600，P；事后分析，P、挖掘 时间均减少[图3：F（2,18）=6.915，P=0.006；事后分析，P=0.007]。 与模型组大鼠相比，干预组大鼠的社交时间[图3A：模型组= 51.000（39.000，64.000），干预组=122.000（85.000，125.000）， Kruskal-Wallis 检验=13.590，P=0.001；事后分析，P=0.001]、 主动追逐时间[图 3A：F（2,18）=36.600，P；事后分析，P< 0.001]、挖掘时间均增加[图 3：F（2,18）=6.915，P=0.006；事后分 析，P=0.013]。说明给予 Thy 干预后模型组大鼠的社会交往 能力增强，探索能力提高。基于以上行为学测试结果，发现 Thy减轻了VPA诱导的ASD模型大鼠的社交缺陷行为。
2.2 Thy可通过SCIN改善ASD大鼠的核心症状
2.2.1 RNA-seq 筛选差异基因 通过 RNA-seq 对 3 组大鼠 筛选差异基因，发现 SCIN 表达差异最为明显。与对照组大 鼠相比，模型组大鼠 SCIN 表达明显增加；与模型组大鼠相 比，干预组大鼠SCIN表达明显下降；且对照组大鼠与干预组 大鼠SCIN表达差异不明显（表3）。SCIN作为一种肌动蛋白 结合蛋白，主要参与细胞骨架的重组和细胞分泌过程，与中 枢神经系统疾病密切相关，提示 SCIN 可能是参与 Thy 改善 ASD核心症状过程的重要调控因子。
2.2.2 Thy可降低 VPA 大鼠 PFC 中 SCIN 蛋白表达水平 根 据RNA-seq结果显示，与对照组大鼠相比，模型组大鼠SCIN 表达水平明显升高；对模型组大鼠给予 Thy干预后，SCIN 表 达水平恢复正常。基于这个结果，进行了Western blot实验， 对各组大鼠SCIN的蛋白水平进行了检测。发现与对照组大 鼠相比，模型组大鼠 SCIN 的蛋白水平明显升高[图 4：F（2，6）= 29.550，P=0.001，事后分析，P=0.001]；对模型组大鼠给予Thy 干预后，SCIN的蛋白水平恢复到正常水平[图4：F（2，6）=29.550， P=0.001，事后分析，P=0.001]，与前一部分结果一致。
3 讨 论
ASD是一种神经发育疾病，目前已知与 ASD发 生相关的主要脑区包括 PFC、海马、杏仁核和下丘 脑。PFC 负责社会行为、情绪处理和决策[13] 。PFC 对哺乳动物社会行为活动的各个方面都至关重要， 包括社会动机、认知和决策等方面[14] 。患有 ASD 的 个体表现出不典型的社会行为和社会认知缺陷，例 如心智受损以及缺乏社交兴趣[15] 。神经影像学研究 显示，患有ASD的个体在社交活动期间的PFC发生 了改变[16] 。
Thy是伞形烃和香芹酚互变异构体的天然酚类 单萜衍生物，具有抗菌、抗氧化、抗癌、抗炎和止咳 活性[17] 。Thy 是一种挥发油，具有易挥发、分子量 小、易穿过血脑屏障、适合治疗脑部疾病等优点[18] 。 已有研究证明，Thy 可预防味精诱导的大鼠注意缺 陷/多动障碍行为[19] ，可以调节慢性不可预见性温和 应激抑郁模型中IL-1β和TNF-α的表达[20] 。有表明 Thy对腹膜炎、胸膜炎、风湿性关节炎以及皮炎等炎 症有良好的抗炎促愈合的作用[21-22] 。Thy 作为一种 补充剂，起到保护神经和弥补认知缺陷的作用，还 可以改善学习和记忆障碍[23] 。有研究表明，Thy 可 以在体内和体外改善肠道微生物群[24] 。在体内模型 中发现肠道微生物群通过产生神经活性代谢物来 调节小鼠的行为[25] 。微生物群-肠-脑轴代表了神 经胶质功能的重要调节剂，使其成为改善神经退行 性疾病发展和进展的可行靶标[26] 。由此可见Thy可 能通过影响肠道微生物群起到改善 ASD 的作用。 因此，通过 RNA-seq 对对照组大鼠、模型组大鼠以 及Thy干预组大鼠筛选差异基因，发现SCIN表达差 异最为明显。与对照组大鼠相比，模型组大鼠SCIN 的 RNA 水平明显增加；与模型大鼠相比，干预组大 鼠 SCIN 的 RNA 水平下降；且对照组大鼠与干预组 大鼠SCIN表达差异不明显。
SCIN 是 1986年学者在牛肾上腺髓质提取出一 种类似凝溶胶蛋白的蛋白，是一种重要的肌动蛋白 结合蛋白，主要参与细胞骨架的重组和细胞分泌过 程[7] ，可能在神经元发育、突触功能和细胞骨架动态 中发挥作用。近来研究表明 SCIN 在机体不同发育 阶段和不同组织、细胞中的表达存在一定的差异， 且功能各异[27-28] ，并且可能与机体生长发育相关。 在实验中通过 Western blot 验证了 RNA-seq 的结 果：与对照组大鼠相比，模型组大鼠 SCIN 蛋白表达 水平明显增加；与模型大鼠相比，干预组大鼠 SCIN 蛋白表达水平下降；且对照组大鼠与干预组大鼠 SCIN表达差异不明显，提示SCIN可能参与Thy改善 ASD 核心症状过程。根据 SCIN 的结构与功能特点 结合以上实验结果可以推测出：由于SCIN参与调节 肌动蛋白细胞骨架，对突触的形成、成熟和可塑性 至关重要。而ASD患者常存在突触功能障碍，因此 SCIN 功能异常很有可能会导致突触结构和功能的 改变，影响神经信息传递，进而引发 ASD 相关的行 为症状。在大脑发育早期，神经元的正确迁移对于 构建正常的神经网络至关重要。SCIN 异常可能会 影响神经元的迁移过程，导致大脑皮层结构异常， 这也是ASD神经病理学的一个特征。
同时，根据对 RNA-seq 的结果进行分析，发现 多种信号通路发生异常，其中包括 Wnt 信号通路。 已有研究证实，沉默 SCIN 可能通过 Wnt/β-catenin 信号通路调控EMT进程从而促进癌细胞的侵袭、增 殖及迁移能力[29] ；Thy 已被证明可调节多种关键信 号通路，包括磷酸肌醇 3-激酶、Wnt信号通路等[30] 。 而在结直肠癌的研究中，Thy 会降低 Wnt/β-catenin 信号通路中细胞周期调节蛋白 c-myc、cyclinD1 的 表达，导致结直肠癌细胞 G0/G1 期阻滞[31] 。更重要 的是，Wnt信号通路与 ASD 密切相关。已有研究表 明，在暴露于 VPA 的小鼠中，差异表达蛋白与 ASD 风险基因以及 Wnt信号通路相关基因明显重叠，包 括 ASD 患者死后皮层中存在的分化表达基因[32] 。 Wnt2基因的突变与ASD的发病呈正相关[33] 。β-catenin 的过度表达可引起神经元细胞的增殖，可能与 ASD 大脑早期的过度增殖有关[34] 。对Wnt信号通路的获 得性和功能丧失性研究发现，Wnt 信号通路与 ASD 相关的大脑发育异常相关[35] 。以上研究提示SCIN可 能是通过调控Wnt信号通路在ASD中发挥着重要的 作用，并将会在后续实验中进一步探究。
综上所述，可以推测出 Thy可能通过抑制 SCIN 表达，从而改善 VPA 诱导的 ASD 大鼠的核心症状， 但其分子机制尚未可知。在后续实验中继续深入 研究 SCIN 参与 ASD 核心症状的作用机制，为进一 步研究ASD提供新思路，同时为ASD干预及治疗提 供新的实验依据。
2.基于UPLC-Q-TOF/MS、网络药理学和分子对接模拟探讨黄连解毒汤治疗痛风性关节炎的药效物质及作用机制
作者：王文婷,冯锦辉,杨珂,李莎,王 斌,刘继平,卫昊,史永恒,王川,王国全
作者单位：陕西中医药大学
关键词：黄连解毒汤;化学成分;超高效液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱;网络药理学;分子对接
【摘 要】目的：利用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（ultra performance liquid chromatography-quadrupole-time of flightmass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）技术对黄连解毒汤（Huanglian Jiedu Decoction，HLJDD）的主要成分进行鉴定。并结合网 络药理学和分子对接验证对HLJDD治疗痛风性关节炎（gouty arthritis，GA）中的潜在作用机制进行探讨。方法：通过UPLC-QTOF-MS技术在采集正、负离子模式下的数据，并结合对照品、相关文献及数据库检索，分析HLJDD的化学成分。利用网络药 理学分析HLJDD治疗GA的潜在机制，筛选活性成分和GA的交集靶点，进一步富集分析和建立可视化网络，分子对接验证活 性成分和交集靶点的结合能力。结果：通过UPLC-Q-TOF/MS方法鉴定出47个成分，采用网络药理学方法筛选得到HLJDD治 疗GA的关键成分54个，交集靶点37个，PPI分析得到其中度值前10的关键靶点。GO功能富集分析得到20种生物过程、7种 细胞组分、8种分子功能。KEGG通路富集分析得到 96条干预 GA相关通路，发现其治疗 GA相关的通路主要涉及 IL-17、TNF 等炎症信号通路。分子对接进一步验证了HLJDD的关键成分与核心靶点结合能力良好。结论：已鉴定的HLJDD中的关键成 分如黄柏碱、黄连碱、汉黄芩素、β-谷甾醇等可能通过调节 IL-17、TNF通路中的多个核心靶点如 PTSG2等来缓解 GA，这为下 一步深入研究作用机制提供了理论依据。
痛风性关节炎（gouty arthritis，GA）是一种常见 的代谢性风湿类疾病和慢性系统性炎症疾病，因长 期发作严重影响患者的生活质量，因此对其研究具 有重要价值。现有研究指出，其病理过程可能为嘌 呤代谢失衡或尿酸排泄功能受损，导致血尿酸浓度 异 常 增 高 ，进 而 促 使 尿 酸 钠（monosodium urate， MSU）晶体在关节腔及周围软组织内逐渐沉积，最 终诱发了 GA[1] 。从疾病发展规律来看，痛风的自然 病程可以被划分成4个阶段：无症状高尿酸血症期、 急性发作期、发作间歇期及慢性痛风石病变急性 期[2-3] ，其中以突发性关节红肿热痛及功能障碍为典 型临床表现。流行病学研究表明，全球 GA 的患病 率为 0.1%~10%，我国最新研究证实其总体发病率 已达 2.86%，且呈现两大明显特征——年增长率持 续走高，发病年龄向年轻人群体迁移[4] 。现在治疗 体系降低尿酸的方式为通过秋水仙碱、非甾体类消 炎 药（nonsteroidal antiinflammatory drugs，NSAID）、 糖皮质激素等药物快速控制炎症反应，但长期使用 这些药物易引发肝肾功能损伤及胃肠道并发症，更 难以解决疾病复发等核心问题[5] 。在此背景下，中医 药在 GA 全程管理中的独特优势逐渐凸显，其通过 多靶点调控改善患者预后的特点，为突破现有治疗 瓶颈提供了新思路[6] 。
黄连解毒汤（Huanglian Jiedu Decoction，HLJDD） 作为清热解毒药方，出自《肘后备急方》，由黄连、黄 芩、黄柏、栀子按3∶2∶2∶3配伍而成。现有药理学实 验证据表明，HLJDD可通过多靶点交互作用发挥广 泛的生物效应，包括调控炎症反应、抑制病原微生 物增殖、改善脂质代谢稳态（如降低血清胆固醇水 平），以及调节血管张力平衡（如稳定血压波动）、抗 肿瘤增殖、氧化应激抑制、神经保护及免疫稳态调 节等[7] 。另一方面，现代研究表明 HLJDD 是以多靶 点、多通路协同来发挥作用，例如不但能通过抑制 核因子 κB（nuclear factor kappa-B，NK-κB）、丝裂原 活 化 蛋 白 激 酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）等炎症通路发挥抗炎作用，而且可通过抑制 NOD样受体热蛋白结构域蛋白3（NOD-like receptor family pyrin domain containing 3，NLRP3）炎症小体 的异常激活、重构肠道微生物群落动态平衡，在代 谢紊乱相关疾病的干预中体现多靶点协同增效作 用。此外，临床观察证实该方可显著缓解 GA 患者 关节症状并降低复发率，但其具体作用靶点及机制 网络尚未完全阐明[8] 。
本研究整合现代分析手段与生物信息学预测 方 法 ，首 先 采 用 UPLC-Q-TOF-MS/MS 技 术 确 定 HLJDD化学成分，继而通过网络药理学筛选HLJDD 治疗 GA 的关键靶点，构建“成分-靶点-通路”多维 互作网络，分子对接验证了关键成分与关键靶基因 之间的结合能力。这种系统研究策略不仅有助于 揭示 HLJDD 治疗 GA 的潜在分子机制，更为经典方 剂的现代化研究提供创新方法学参考。
1 材料与方法
1.1 试剂
黄连饮片（批号：S20240701，产地重庆）、栀子饮片（批 号：240701，产地江西）、黄芩饮片（批号：S20221201，产地山 西）、黄柏饮片（批号：20240712，产地四川），上述饮片均由北 京同仁堂咸阳药店有限责任公司提供，均符合《中国药典》 2020年版有关规定。色谱级甲醇购自天津市科密欧化学试 剂有限公司，色谱级乙腈购自美国 Sigma 公司，质谱级甲酸 来自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。
1.2 仪器
Waters 公司（美国）提供的 ACQUITY UPLC H-Class 超 高效液相色谱系统与 Xevo G2-XS Q-Tof高分辨质谱联用平 台；昆山超声仪器有限公司生产的超声处理装置；赛多利斯 集团（北京）研发的精密分析天平；以及理化器械株式会社 （东京）制造的FDU-2100型真空冷冻干燥系统。
1.3 方法
1.3.1 HLJDD的成分分析
1.3.1.1 溶液的配制 ①供试品溶液。按处方称取4味药材 饮片（黄连 9 g、栀子 9 g、黄芩 6 g、黄柏 6 g），浸泡 30 min，药 材按10倍与8倍纯化水分2次煎煮，各30 min。趁热过滤后 合并 2次的滤液，用旋转蒸发仪浓缩至微黏稠状态。-80 ℃ 预冻后冷冻干燥机干燥24 h，超微粉碎得到冻干粉。精确称 取 100 mg 冻干粉，溶解于 5 mL 色谱甲醇中，12 000 r/min 离 心10 min得到上清液，上清液经0.22 μm滤膜过滤后避光保 存待测。②对照品溶液。精密测定黄柏碱、巴马汀、汉汉黄 芩素、黄连碱、栀子苷、黄芩苷、栀子苷酸及汉黄芩素对照品 适量，分别以色谱级甲醇为溶剂配制成单一组分浓度为100 μg/mL 的对照品溶液，上清液经 0.22 μm 滤膜过滤后避光保 存待测。
1.3.1.2 测 定 条 件 ① 色 谱 条 件 。 色 谱 柱 ：Waters ACQUITYUPLCBEHC18（2.1 mm×100.0 mm，1.7 μm），流动 相：乙腈（A）-0.1% 甲酸水溶液（B），洗脱梯度（0~1 min， 5%A；1~5 min，5%~26%A；5~9 min，26%~28%A；9~12 min， 28%~98%A；12~15 min，95%~95%A），进 样 量 1 μL，柱 温 35 ℃，流速 0.3 mL/min。②质谱条件。离子化方式：电喷雾 离子源（electrospray ionization，ESI），采用正负离子分析模 式检测；采集方法：Fast DDA；一级质谱扫描范围（m/z）：100~ 1 200；二级质谱扫描范围（m/z）：50~1 000；采集二级离子碎 片；毛细管电压：3.0 kV；锥孔电压：50 V；源温度：100 ℃；去 溶剂气温度：400 ℃；去溶剂气流速：800 L/h，锥孔气流速： 50 L/h；正负离子碰撞能：低质量端能量设置为 6 eV，高质量 端能量设置为10~50 eV。
1.3.2 网络药理学探讨HLJDD治疗GA的作用机制
1.3.2.1 活性成分及靶点的筛选 根据中药系统药理学分 析平台（TCMSP，http://tcmspw.com/TCMSP.php）的标准（OB≥ 30% 和 DL≥0.18），初步筛选 HLJDD 的化学成分。根据化学 成分的鉴定结果，建立HLJDD的潜在活性成分数据库，并利 用 Uniprot 蛋白质数据库（https://www.uniprot.org/）将化合物 的蛋白质靶点标准化为相应的基因符号（Gene Symbol）作为 药物活性靶点。在 Genecards（https：//www.genecards.org）、 Disgene（t https://disgenet.com/）数据库中以“gouty arthritis”为 关键词检索疾病靶点，采用中位数原则筛选后得到GA的潜 在靶点。对药物活性靶点与疾病靶点的可视化交集分析在 Venny 在 线 分 析 平 台（https://bioinfogp. cnb. csic. es/tools/ venny/）进行，通过韦恩图展示二者共有的核心作用靶点。
1.3.2.2 蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interac⁃ tion network，PPI）网络构建 将共有的核心作用靶点上传至 STRING蛋白互作网络分析平台（https://cn.string-db.org/），构 建靶点间潜在相互作用关系图谱。随后，使用 Cytoscape 3.10.1 软件中 CytoHubba 插件根据节点的度值（degree）筛选 出从PPI网络中前10个关键核心靶点。
1.3.2.3 KEGG 通路分析与基因本体（gene ontology，GO）富 集分析 对关键核心靶点在DAVID功能注释数据库（https:// david.ncifcrf.gov/）进行GO注释及KEGG通路的富集分析，设 定显著性阈值（P），筛选排名前 15 的显著性条目可 视化。
1.3.3 分子对接
将筛选的10个核心成分作为分子对接中 的配体，从 PubChem 数据库（https://pubchem. ncbi. nlm. nih. gov/）下载配体的 SDF 格式文件，转换为 mol2 格式文件用 chem 3D 软件；将 Top 10 核心靶点作为分子对接中的受体， 从PDB数据库（https://www.rcsb.org/）下载PDB格式文件。将 准备好的配体和受体文件使用 Auto Dock Tools 1.5.6软件进 行加氢、去水、计算电荷等处理，然后保存为 pdbqt格式以用 来分子对接。运用 Autodock vina 对活性成分和核心靶点分 子对接以计算结合能，使用 origin 软件用热图表示对接结 果，最后采用PyMOL软件对结合能最低的进行可视化。
2 结 果
2.1 基于UPLC-Q-TOF-MS的HLJDD化学成分鉴定 在上述色谱和质谱条件下对 HLJDD 供试品进样分析， 得到样品正、负离子扫描模式下的总离子流图，见图 1。采 用一级质谱全扫描和提取离子峰的方法，确定了 HLJDD 63 个色谱峰，确定了47个化合物（表1）。经过与对照品的保留 时间、精准相对分子质量比较，准确鉴定出8个化合物（黄柏 碱、巴马汀、汉汉黄芩素、黄连碱、栀子苷、黄芩苷、栀子苷酸、 汉黄芩素）；通过与文献提供的保留时间、相对分子质量、结 构式、离子碎片对比，推测了其他35个化合物结构。47个化 合物包括黄酮、有机酸、生物碱等多种化合物，其中黄酮类 14个，生物碱类13个。
2.1.1 黄酮类成分质谱解析 本研究通过质谱分析从 HLJDD中成功表征出14种黄酮类成分，选取其中编号36的化 合物作为典型代表探讨其质谱裂解特征。在正离子扫描模 式下，该化合物检测到准分子离子峰m/z 447.166 4（[M+H] + ）， 经精确质量数计算推导其分子式为 C21H20O11。二级质谱 分析显示特征碎片离子包括 m/z 287.125 4（[M+H-Glu] + ）、 269.112 7（[M+H-Glu-H2O] + ）及 241.115 3（[M+H-Glu-H2OCO] + ），据此推断其可能为黄芩苷或其结构类似物。碎片离 子 m/z 287的形成源于前体离子脱去一分子葡萄糖基团，后 续脱水反应生成m/z 269碎片，而m/z 241则对应进一步丢失 一氧化碳分子产生的特征峰。通过对照品保留时间比对及 文献数据[9] ，确定化合物36为黄芩苷。
2.1.2 生物碱类化合物 从 HLJDD 质谱结果中表征出 13 种生物碱类化合物。选编号 15 的化合物作为典型代表探 讨其质谱裂解特征。在正离子扫描模式下，其分子离子 峰 为 m/z342.244 7[M] +，经精确质量数计算推测其分子式 为 C20H24NO4 。 二 级 质 谱 分 析 显 示 特 征 碎 片 离 子 包 括m/z192.164 4[M+H-Glu] + 、177.138 5[M+H-Glu-CH3] + 、148.133 9 [M+H-Glu-CH3-CHO] + 碎片离子，初步推测该成分为黄柏碱 或其异构体。其中m/z 192是由前体离子断裂1分子葡萄糖 所致，再进一步脱去1分子甲基形成m/z 177，m/z 148则为前 体离子依次脱去 1分子 CHO 离子后生成。通过对照品保留 时间比对及文献数据[10] ，确定化合物15为黄柏碱。
2.2 HLJDD治疗GA的关键成分和靶点分析
通过相关数据库结合质谱分析结果，最终筛选出 54 个 活性成分，主要活性成分前 10 见表 2，得到 250 个 HLJDD 成 分相关靶点。此外，得到 484 个 GA 相关潜在靶点。通过韦 恩图取交集，最终获得共同靶点37个。
2.3 PPI网络
从String数据库导出生成的原始PPI网络图（图2），下载 TSV 文件。将该文件导入 Cytoscape 3.10.1 软件构建 PPI 网 络图（图3），节点的颜色深浅代表度值的大小，度值越大，表 示该节点与其他蛋白质的相互作用越强。数据结果显示，该 网络包含37个节点和686条边，通过度中心性、介数中心性、 接近中心性指标筛选，得出前10个核心蛋白（表3）。
2.4 富集分析结果
GO富集得到35个GO条目（图4），其中生物学过程（bio⁃ progress，BP）条目20个，包括炎症反应、基因表达的正调控、 生物刺激反应、细胞凋亡过程的正调控、细胞老化、IL-8、IL6的正调控、活性氧代谢的正调控等方面；7个细胞组分（cell components，CC）条目，包括膜筏、细胞外基质、质膜、内质网 腔、神经元投射等；分子功能（molicular function，MF）条目 8 个，包括丝氨酸型内肽酶活性、细胞因子活性、酶结合、相同 蛋白质结合、血红素结合、生长因子活性、趋化因子活性和前 列腺素内过氧化物合成酶活性。京都基因和基因组数据库 （Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集得到 16条通路，主要包括NOD样受体通路、TOLL样受体通路、晚 期糖基化终末产物（advanced glycation end product，AGE） -AGE 受体（RAGE）信号通路、白细胞介素-1（interleukin-1, IL-1）信号通路、TNF 信号通路及 NF-κB 信号通路等，取前 15条信号通路进行可视化分析（图5）。
2.5 “药物-活性成分-疾病-靶基因-通路”网络图
将 54 个药物活性成分、37 个交集靶基因、前 15 条信号 通路导入 Cytoscape 3.10.1软件，构建“药物-活性成分-疾病 靶基因-通路”网络，进行可视化分析，见图6。分析网络图，共有328个节点，1 331条边。
2.6 分子对接验证结果
将前 10 的核心靶点（IL6、PPARG、IL1B、TNF、MMP9、 PTGS2、CXCL8、IL10、TGFB1、RELA）与前 10的活性成分（槲 皮素、β-谷甾醇、黄连碱、汉汉黄芩素、巴马汀、栀子苷、黄芩 苷、黄柏碱、小檗碱、栀子苷酸）进行分子对接，得出的分子对 接结合能结果的热图（图 7）。结果显示 HLJDD 治疗 GA 的 关键活性成分和核心靶点结合能均，对接情 况良好。利用 PyMol 软件可视化结合能相对较低的成分与 靶点的组合，见图8。
3 讨 论
HLJDD作为中医经典方剂，在临床实践中一直 发挥重要作用，具有明显的泻火解毒效果，用于三 焦火毒证。随着现代医学研究的深入，HLJDD在临 床应用中的适应证范围得到了进一步拓展，如脑缺 血、肿瘤等[11] 。HLJDD 包含黄连、黄芩、黄柏和栀子 多味药材，其化学成分复杂，包含生物碱、黄酮类、 酚类等多种活性成分，然而传统的 HPLC 或低分辨 质谱方法，分析效率和分辨率都较低，不能满足化 学物质基础及作用机制研究的精确需求[12-13] 。而 UPLC-Q-TOF-MS 有高分辨率、高灵敏度和强大结 构解析能力的优点，已成为复杂体系中化合物表 征、定性和定量分析的重要工具，并成功用于药物 分 析 领 域 。 本 实 验 利 用 UPLC-Q-TOF-MS 对 HLJDD 的化学成分进行分析，通过对照品、保留时 间 、碎 片 信 息 、文 献 分 析 多 种 方 法 综 合 识 别 了 HLJDD 水提物的化学成分，结果共鉴定出 63 个色 谱峰，47种化合物。其中包括 14种酮类化合物，13 种生物碱类化合物，其他化合物20种。并在结果中 选出与HLJDD治疗GA相关的主要活性成分为槲皮 素、β-谷甾醇、黄连碱、汉黄芩素、巴马汀、栀子苷、 黄芩苷、黄柏碱、小檗碱、栀子苷酸。对筛选出的活 性成分进行相关的文献研究，发现上述成分可以通 过多通路来缓解 GA。有文献报道表明槲皮素可以 通过抑制NLRP3炎症小体的激活来减轻炎症反应， 从而能显著降低尿酸水平，以缓解GA[14] 。黄连碱缓 解GA时，发挥抗炎作用的机制与TLR4炎症信号转 导通路和NF-κB炎症信号通路有关[15] 。巴马汀通过 调节 NF- κB/NLRP3 和 Nrf2 通路预防 MU 诱发的 GA[16] 。黄芩苷可通过下调 mTEN/PI3K/AKT/mTOR 信号通路的激活，来缓解GA[17] 。其他成分缓解GA的 作用机制尚未查到相关文献报道，需要进一步研究。
本研究网络药理学部分筛选出37个交集靶点， 其中度值前 10 的依次为 IL6、PPARG、IL1B、TNF、 MMP9、PTGS2、CXCL8、IL10、TGFB1、RELA，这些可 能是 HLJDD 治疗 GA 的关键靶点。IL6、IL1B、TNF、 CXCL8、MMP9、PTGS2、RELA 为常见的促炎细胞因 子，促进炎症因子分泌、中性粒细胞聚集以及组织 破坏。HLJDD在GA急性发作时通过下调这些蛋白 的 表 达 ，来 对 GA 局 部 组 织 发 挥 抗 炎 作 用[18] 。 PPARG、IL10、TGFB1为抗炎与修复靶点，参与炎症 后期的调控和平衡，减轻炎症反应并促进组织修 复，可能作为 GA 潜在的治疗靶点[19] 。富集结果发 现 HLJDD 对 GA 发挥保护作用涉及炎症反应、细胞 迁移的正调控、细胞分化的负调控、调节活性氧代 谢过程等生物过程，相关通路为 IL-17、TNF等炎症 信号通路。已有研究认为通过抑制IL-17通路相关 蛋白的表达，可抑制炎症级联反应的扩大，缓解 GA[20] 。TNF 作为经典抗炎通路，其上下游通路如 TLRs、NF-κB 信号转导通路都是抑制 GA 相关蛋白 表达的常见通路[21] 。此外，研究还发现每个化合物、 通路对应的靶标蛋白有所重合，这说明HLJDD通过 多成分、多靶点、多通路协同途径对GA的炎症反应 进行调控从而发挥治疗作用。分子对接进一步验 证了网络药理学分析的结果。关键成分都与核心 靶基因的对接得分较高，展现出较强的靶点结合能 力，这表明具有明显的生物学活性，其中 PTGS2 与 多个关键成分都结合良好，可能是 HLJDD 治疗 GA 的主要潜在靶点。
综上所述，本研究鉴定出 HLJDD 的有效成分， 分析HLJDD质谱中各类化合物的裂解规律。此外， 通过网络药理学筛选 HLJDD 治疗 GA 的核心成分、核心靶点和相关通路，以预测 HLJDD 治疗 GA 的可 能作用机制。最后，通过分子对接验证了核心成分 和核心靶点之间的结合能力良好，为HLJDD的质量 控制，HLJDD 治疗 GA 的功效及作用机制验证提供 了理论基础和科学依据。
3.非小细胞肺癌免疫治疗热点问题解析
作者：张志敏,章必成
作者单位：武汉大学
关键词：非小细胞肺癌;免疫治疗;解析
【摘 要】以免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICIs）为代表的免疫治疗已在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者中广泛应用并取得了明显的治疗效果，获得国内外多个指南或专家共识的推荐。然目前的NSCLC免疫治 疗中仍存在一些争议性的临床问题值得探讨，例如：围术期免疫治疗选择、免疫耐药机制及耐药后的治疗策略、免疫治疗疗效 评估、免疫不良反应的管理、驱动基因阳性患者免疫治疗策略、特殊人群免疫治疗选择以及其他关注的免疫治疗临床问题等。 本文列举了NSCLC免疫治疗中的7个热点问题并逐一进行解析，以期给肿瘤临床医师带来帮助。
非小细胞肺癌是我国最常见的恶性肿瘤[1] ，发病率和死 亡率均高居前列。近十年来，以免疫检查点抑制剂为代表的 免疫治疗已成为 NSCLC 的主要治疗手段 ，深刻改变了 NSCLC 治疗的临床实践。然而，在为 NSCLC 患者带来生存 获益的同时，很多治疗中的相关临床问题仍未取得高级别循 证学证据或形成确定性的结论。因此，本文梳理了 NSCLC 中免疫治疗的相关7个热点问题并逐一进行解析，期望给临 床医生带来一定帮助。
1 NSCLC围术期免疫治疗选择
近几年，围绕围术期免疫治疗的探索越来越多，而随 着多项国内外Ⅲ期临床研究结果的披露，新辅助免疫、辅 助免疫，以及“新辅助免疫-手术-辅助免疫治疗”的夹心 饼式治疗模式正成为当下 NSCLC 围术期治疗的新标准， 围术期免疫治疗进入了新时代[2] 。目前已取得阳性结果 的围术期免疫治疗重要的Ⅲ期临床实验包括：Checkmate816[3] 、IMpower010[4-5] 、KEYNOTE-091[6] 、KEYNOTE-671[7] 、AEGEAN[8] 、CheckMate-77T[9] 、NEOTORACH[10] 、RATIONALE315[11] 等（表 1）。而基于现有循证医学证据已达成了相应的 共识，但仍存在许多争议问题值得探讨。
1.1 新辅助治疗阶段的免疫治疗策略
基于多项针对Ⅱ~Ⅲ期 NSCLC 患者（第 8版 AJCC 分期） 新辅助免疫治疗或围手术期免疫治疗的Ⅲ期临床试验结果， 对于不同分层患者的治疗具有以下推荐：①可手术切除的 Ⅱ~ⅢB期 NSCLC 是新辅助免疫联合化疗的主要适用人群， 尤其对于可切除的Ⅲ期患者疗效明确。②对于潜在不可切 的Ⅲ期 NSCLC 患者（包括ⅢB 和 N2），新辅助免疫联合化疗 可显著提高病理学显著缓解（major pathological response， MPR）率 和 病 理 完 全 缓 解（pathological complete response， pCR）率，致使这一部分患者有机会在新辅助免疫联合化疗 后获得手术治疗机会。③对于Ⅱ期患者是否获益，不同研究 的结果有所差异，需要更多的相关研究来筛选获益。④在充 分评估患者基线情况（包括肿瘤大小、部位、患者生命体征及 安全性等因素）后，对于可切除的Ⅱ~Ⅲ期 NSCLC 患者术前 可行3~4个周期的免疫联合化疗再决定是否手术。
1.2 辅助治疗期间的免疫治疗策略
对于术后辅助治疗期间的免疫治疗策略，目前有以下推 荐：①对于术前新辅助治疗未使用免疫的患者来说，术后采 用化疗后序贯免疫治疗的方案是有获益的。IMpower-010 研究[4-5] 和KEYNOTE-091[6] 研究等多项研究均证实术后含铂 化疗后序贯免疫辅助治疗可促进无病生存期（disease-free survival，DFS）明显延长，但 KEYNOTE-091 研究亚组分析提 示程序性细胞死亡受体1（programmed cell death-1，PD-1）高 表达（PD-1≥50%）患者获益趋势不明确[6] 。因此，需要通过 探索新的生物标志物来进一步筛选辅助免疫治疗的优势人 群。②对于术前已接受过新辅助免疫治疗的患者，术后继续 免疫单药维持治疗能够降低复发风险，明显改善术后总生存 期（overall survival，OS）和无事件生存期（event-free survival， EFS）。③目前对于新辅助免疫治疗手术后已达到pCR的患 者是否还需要继续辅助免疫治疗尚存在争议，特别是Check‑ Mate-816[3] 随访 4 年的数据结果和 CheckMate-77T[9] 亚组分 析结果不完全一致，因此，对于这一部分患者需要平衡辅助 免疫治疗带来的安全性风险和经济负担来慎重抉择。若患 者术后辅助治疗意愿强烈，建议进行微小残留病变（minimal residual disease，MRD）检测，根据MRD结果判断是否需要术 后辅助治疗。同时也要明确目前MRD检测仍处于临床探索 阶段，临床应用有限，未来期望更多关于MRD检测临床应用 数据的更新。④至于术后辅助免疫治疗的时长，多个临床研 究设计都将术后免疫辅助治疗时间定为最长至 1 年[4-11] ，因 此，对于这部分患者来说，术后应再行1年的辅助免疫治疗。
综上，目前 NSCLC 围术期免疫治疗的研究包括 3 种模 式：术前新辅助免疫联合化疗+手术、手术+术后辅助免疫治 疗和新辅助免疫联合化疗+手术+辅助免疫治疗，但目前为 止尚未有这 3 种治疗模式的头对头临床研究来比较哪种方 式更优，因此临床上还是要综合评估临床获益风险，安全性 风险和经济风险等因素，个体化选择治疗模式。当然，也期 待未来会有更具说服力的围术期免疫治疗临床试验结果来 解决问题。
2 NSCLC 免疫治疗的耐药机制及耐药后的治疗 策略
2.1 免疫耐药的定义
无论何种抗肿瘤药物最后都会出现不同程度的耐药或 者严重不可耐受的毒副反应，而不同文献和研究对于免疫耐 药也有不同的描述和定义。目前相关研究将PD‑1/程序性细 胞死亡受体配体 1（programmed cell deathligand 1，PD-L1）治 疗耐药分为 3 种类型：原发性耐药、继发性耐药和治疗中断 后的进展[12] 。中国临床肿瘤学会（Chinese Society of Clinical Oncology，CSCO）NSCLC专委会于2024年进一步对免疫耐药 的定义与分类进行了规范和推荐[13] ，在治疗模式上细分为： 免疫单药，免疫-免疫联合，免疫-化疗联合以及免疫-靶向 联合治疗的耐药。而这 4 种治疗模式中的原发性耐药指药 物暴露时间≥6周（2周期）的治疗后，对初始治疗缺乏反应，6 个月内出现疾病进展（progressive disease，PD）或者疾病稳定 （stable disease，SD）时间<6个月。
对于继发性耐药，目前临床实践中还存在争议，不同治 疗模式定义也不同。①免疫单药和免疫-免疫联合治疗的 继发性耐药定义为药物暴露时间≥6 周（2 周期）或者超过 6 个月，疗效评估为完全缓解（complete response，CR）、部分缓 解（partial response，PR）或 SD 超过 6 个月，此后按照实体瘤 疗效评价标准 1.1（response evaluation criteria in solid tumors， RECIST）评估为 PD，并建议行影像学再次确认，确证时间为 PD 至少 4 周后。②免疫-化疗联合治疗的继发性耐药或迟 发性耐药指初始治疗 6 个月以上出现的 PD，进展后不需要 再次确认。③免疫-靶向联合治疗的继发性耐药定义中药 物暴露时间和 PD 时间限制同免疫-免疫联合治疗，但评估 进展后不需要再次确认。④目前多数专家推荐：一线免疫治 疗缓解的患者，继发性耐药中药物暴露时间设为至少2个周 期，且没有持续缓解时间的要求；而疗效评估为 SD 的患者， 药物暴露时间和病情稳定持续时间设为超过6个月[13] 。
2.2 免疫耐药的机制
免疫耐药的机制复杂，与传统化疗和靶向等治疗的耐药 机制不完全相同，其更多涉及肿瘤自身、肿瘤外和机体免疫 等多方面因素。目前研究明确的机制包括：肿瘤内源性、肿 瘤外源性和宿主相关机制[13-14] 。
肿瘤内源性机制主要涵盖：①基因突变及信号转导通路 的 异 常 ，涉 及 通 路 有 TP53 基 因 突 变 、PTEN/PI3K/AKT/ mTOR、JAK-STAT 和 MAPK、抗原递呈（antigen-presenting， AP）信号通路、干扰素-γ信号通路等；②肿瘤抗原缺失或减 少、肿瘤抗原呈递受阻；③表观遗传学改变，例如：DNA高甲 基化等。当然其他相关机制还包括了 PD-L1 低表达的影 响等。至于肿瘤外源性机制多与免疫抑制性肿瘤微环境 （tumor microenvironment，TME）密切相关，涉及免疫抑制和 效应细胞、免疫抑制因子、替代免疫检查点、血管内皮生长因 子以及 TME 代谢重编程等。最后，宿主相关机制也是免疫 耐药的重要影响因素，目前研究发现患者的性别、年龄、遗传 史、基础疾病、生活习惯等[15-16] 都与 NSCLC 免疫耐药相关， 而肠道微生物、抗生素和激素的应用等都可影响免疫治疗 疗效。
2.3 耐药后的治疗策略
目前 PD-1/PD-L1 已经成为 NSCLC 治疗中不可或缺的 一环，如何克服耐药仍是值得进一步探讨的问题。基于目 前免疫治疗耐药机制的研究进展，仍有以下的治疗策略可 供选择。
2.3.1 针对免疫治疗寡进展的治疗选择 免疫治疗寡进展 的定义目前还有争议。多数专家认为接受系统治疗的患者 ≤3个[17-19] 或有限数量的复发灶或转移灶可定义为寡进展，同 时还要评估进展的部位、数目及是否适用于局部治疗等相关 因素综合判定。对于寡进展且体力状态评分较好的患者可 以继续原方案免疫跨线治疗或免疫联合化疗和（或）靶向治 疗，同时配合寡进展部位的局部治疗，如手术、消融、热疗、介 入以及放疗等。如患者一般状态快速恶化，建议按照免疫治 疗广泛进展后的治疗选择。
2.3.2 针对免疫治疗广泛进展的治疗选择 免疫治疗后广 泛进展定义相对明确，其治疗策略涵盖：全身化疗、化疗联合 抗血管生成治疗、免疫再挑战并联合疗法以及其他新型治疗 方案[13-14，20] 。
目前相关研究显示一线免疫耐药或免疫联合化疗耐药 的患者，二线选择全身化疗[21] 或化疗联合抗血管生成治疗[22] 等仍能带来一定的生存获益，但是否可以重启免疫再挑战存 在争议。
免疫再挑战是指既往接受免疫治疗但是因为免疫相关 不良反应（immune‑related adverse events，irAE）、免疫耐药或 临床试验完成既定计划等任何因素导致的免疫治疗终止，经 过评估后再次重新接受免疫治疗的用药模式[13，23] ，包括同种 或者另一种免疫药物。目前对于免疫再挑战的推荐包括： ①对于首次免疫治疗获益的晚期NSCLC患者如因临床试验 设计而中止的免疫治疗，免疫再挑战后仍可以带来生存获 益；②对于 irAE 中断的免疫治疗患者免疫再挑战并不会带 来比停药更多的疾病缓解和 PFS/OS 获益，并且需要防范 irAE 的复发和加重[24-25] 。③继发性免疫耐药由于缺乏足够 的免疫再挑战相关证据，因此还是优先推荐行化疗、靶向或 放疗等穿插治疗后再酌情考虑。④相较于单药免疫，免疫再 挑战联合疗法包括免疫联合化疗、双免治疗、免疫联合放疗、 免疫联合靶向、免疫联合抗血管生成等具有更好的疗效[13] 。
2.3.3 其他新型治疗 目前还有很多针对 NSCLC免疫耐药 的新型治疗方案正在进行临床或临床前研究，包括抗体偶联 药物（antibody‑drug conjugate，ADC）、靶向其他抑制性免疫检 查点分子或抗体（LAG-3、TIM-3、腺苷 A2A 受体、B7-H3、 CD39 及 CD73）、组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacety‑ lase inhibitors，HDACi）、新型肿瘤疫苗、自体肿瘤浸润淋巴 细胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）疗法、微生物移植疗 法 、靶 向 DNA 损 伤 修 复 基 因（DNA damage repair gene， DDR）、纳米技术等[13-14] 。虽然目前临床研究结果多数尚不 成熟，但是未来可期。
3 免疫治疗疗效评估--假进展与超进展
免疫治疗的应答模式和传统细胞毒性治疗不同，它存在 2 种特殊进展：假进展和超进展（hyperprogressive disease， HPD）。
3.1 假进展
假进展指免疫治疗期间淋巴细胞和（或）炎性细胞浸润 等导致的肿瘤体积增大或者出现新病灶，根据RECIST1.1的 标准可判定为进展，但随着免疫治疗时间延长其发展最终演 变为增大-缩小，亦或是稳定-持续缩小的情况。由于假进 展并不是真正的肿瘤细胞增殖引起，因此诊断上容易出现偏 差，临床多依靠组织活检明确诊断。整体肿瘤免疫治疗中的 假进展发生率为 8%~10%，而 NSCLC 免疫治疗出现假进展 的比例约5.0%[26] 。
3.2 超进展
HPD指免疫治疗期间出现快速的肿瘤负荷增加和病情 恶化的现象。目前 HPD 定义并没有完全统一，多数专家认 为 HPD 需要满足 3 个条件：肿瘤动力学（进展速度>2 倍）， RECIST 百分比（ICIs 治疗期间肿瘤负荷增加>50%）和持续 治疗时间（治疗失败的时间个月）。不同瘤种出现HPD的 比例在 4%~29%[27] ，其中 NSCLC 免疫治疗不同定义下 HPD 的发生率为5.4%~18.5%[28] 。
3.3 免疫治疗疗效评估
由于传统 RECIST 标准不能准确评价免疫治疗的疗效 和生存获益情况，因此，目前临床多采用实体瘤免疫治疗疗 效评估标准（immune response evaluation criteria in solid tu‑ mors，iRECIST）作为晚期 NSCLC 一线免疫治疗疗效的评估 标准。iRECIST标准是将 RECIST 1.1标准疗效评定为 PD的 患者先判定为疑似疾病进展（unconfirmed progressive dis‑ ease，iUPD），根据具体临床情况综合判断是否继续用药，同 时需要在一定时间内观察并再次评定确认是否为确定疾病 进展（confirmed progressive disease，iCPD）[13] 。其中，iUPD 患 者可继续使用免疫治疗，iCPD 和 HPD 需要考虑更换其他治 疗方案。此外，实体肿瘤 PET/CT 免疫治疗疗效评价标准 （immune PET response criteria in solid tumors，iPERCIST）[29] 和 外周血中的循环肿瘤 DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）[30] 也可以辅助区分免疫治疗的假进展、HPD和真实进展。
4 免疫治疗不良反应管理策略
随着免疫治疗在 NSCLC 中的大量应用，出现免疫相关 不良事件（immune-related adverse events，irAEs）的情况也逐 年增加[31] 。自 2017 年起，国内外出版了并更新了多版指南 或共识用于指导irAEs的识别和管理；其中，CSCO自2019年 起隔年出版《ICIs相关的毒性管理指南》[32] ，不断更新最新研 究进展，为临床 irAEs管理提供了可靠保证。与传统化疗和 靶向治疗等不同，irAEs是免疫系统激活后对机体正常组织 器官的过度免疫所致的免疫系统疾病，具有独特的临床特点且临床表现多样化，几乎所有器官都可累及。最常见 irAEs 包括了皮肤反应（如皮疹、瘙痒）、消化道反应（如腹泻、结肠 炎）、内分泌反应（如甲状腺功能亢进或减退、肾上腺功能不 全）、肺炎（免疫介导性肺炎）、肝炎（免疫介导性肝炎）、心肌 炎、神经系统毒性（重症肌无力）等，而NSCLC患者更易发生 免疫治疗相关性肺炎。
4.1 irAEs的诊断
在 irAEs的诊断上目前主要以排他性诊断为主，遵循疑 罪从“有”的原则，即在免疫治疗联合疗法中，如果免疫与其 他治疗具有相似的不良反应（adverse effects，AEs）特征时，经 充分医学评价仍无法确定所发生的 AEs 是否 irAEs，临床上 需用保守方法，将AEs视为irAEs，不应仅依据两者特征相似 而轻易排除irAEs [33] 。
4.2 irAEs的发生时间
irAEs的发生时间多在治疗2~16周内出现，也有数天内 和治疗结束超过1年后发生，而治疗前4周内首次出现irAEs 的风险比4周至治疗结束期间高3倍[34] 。目前研究发现细胞 毒 性 Ｔ 淋 巴 细 胞 相 关 抗 原 -4（Cytotoxic T-lymphocyteassociated antigen 4，CTLA-4）单抗的irAEs呈剂量依赖性，而 PD-1或PD-L1单抗的irAEs既无剂量依赖性，也非周期依赖 性[35] 。同时，免疫联合治疗中 irAEs 的发生率和严重程度有 一定增加，出现时间可能会提前。当然大部分 irAEs为可逆 性，能在短期内恢复，而仅有少数发生致命性的 irAEs，依次 是心肌炎、肌无力、严重皮肤AEs、肌炎和肺炎等[32-33] 。
4.3 irAEs的治疗
irAEs的治疗国内外多项指南或共识推荐以糖皮质激素 为主，根据情况酌情加用麦考酚酯（mycophenolate mofetil， MMF）、静注免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin，IVIG） 等免疫抑制剂以及血浆置换等治疗方式。对于确定或可疑 irAEs，早期、足量激素干预可明显改善预后，首选甲基强的 松龙或强的松等中效制剂。激素减量应逐步进行，一般需要 至少 4 周，有时需 6~8 周或更长时间，特别是在治疗免疫性 肺炎和肝炎时，减量太快，容易出现病情反弹。减量遵循的 一般原则包括：①选择irAEs恢复至G1级或基线水平之时开 始减量；②若症状明显改善，可视具体情况按每周 5~10 mg 递减；③对于激素初始剂量较大且症状改善较快，需要视具 体情况灵活减量；④如果在激素正常减量过程中出现病情反 弹，可酌情加用其他免疫抑制剂[33] 。对于重症型、难治性和 多重irAEs，强调多学科综合治疗（multidisciplinarytreatment， MDT）模式，发挥各学科优势综合治疗。
5 驱动基因阳性NSCLC患者的免疫治疗
以表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor， EGFR）基因突变为代表的驱动基因阳性NSCLC一直被认为 不适合行免疫治疗，特别是免疫和靶向同步治疗，其主要原 因是疗效不明确且易发生严重irAEs。但是随着近几年对靶 向药物免疫调节机制研究的深入和临床循证学证据的出现， 免疫治疗逐渐成为驱动基因阳性NSCLC患者的治疗可选择 的策略之一。
5.1 不同驱动基因阳性NSCLC的免疫治疗选择
目前，参考最新的《晚期驱动基因阳性非小细胞肺癌免 疫治疗专家共识（2023 版）》[36] 意见，对于驱动基因阳性 NSCLC的免疫治疗有如下推荐：①晚期初治的EGFR敏感突 变NSCLC患者不推荐使用免疫治疗。②对于表皮生长因子 受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptortyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKI）耐药后进展的患者建 议再次组织活检，并优选涵盖肿瘤相关和免疫微环境相关的 生物标志物的高通量基因检测。这部分患者根据具体情况 可推荐使用以免疫治疗为基础的综合治疗策略，包括：免疫 联合化疗±抗血管生成治疗、双免治疗、免疫联合局部放疗 等。③晚期初治的间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）融合和ALK-TKIs发生耐药后的NSCLC治疗不 推荐免疫治疗。④晚期Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物 （Kirsten rats arcoma viral oncogene homolog，KRAS）突 变 的 NSCLC患者可一线推荐免疫治疗为基础的治疗策略，包括： KRAS G12C 以及伴有耐药突变的 KEAP1 或 STK11。⑤BRaf 原癌基因，丝氨酸/苏氨酸激酶（B-Raf proto-oncogene， serine/threonine kinase Gene，BRAF）非V600突变患者推荐一 线使用以免疫治疗为基础的治疗策略；对于 BRAF V600 突 变患者，推荐在靶向治疗不可及或耐药后发生广泛进展时考 虑使用以免疫治疗为基础的治疗策略。⑥人类表皮生长因 子受体 2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2） 突变患者推荐使用以免疫治疗为基础的治疗策略；间质-上 皮 细 胞 转 化 因 子（mesenchymal-epithelial transition factor， MET）14 外显子跳跃突变患者在靶向治疗耐药或不可及时 可使用以免疫治疗为基础的治疗策略。⑦c-ros肉瘤致癌因 子-受体酪氨酸激酶（ROS proto-oncogene 1，receptor tyrosine kinase，ROS1）融合和 RET（Rearranged during transfection）重 排患者靶向药物可及应优先使用，是否推荐使用免疫治疗未 达成一致性结论，有待更多临床研究提供依据。
5.2 驱动基因阳性NSCLC的免疫治疗安全性评价
相关临床研究和循证学证据提示 ICIs 与靶向药物联用 存在安全风险，但是也存在一定的差异[36] ：①多数专家认为 EGFR-TKIs 或 ALK-TKIs 与 ICIs 联用存在很高的安全性风 险，故不推荐同时使用。②MET-TKI 和 KRAS G12C 抑制剂 与免疫联合治疗的部分早期研究观察到安全性风险，有待进 一步验证。③关注靶向药物和免疫药物序贯使用过程中的 “洗脱期”（Washout period）。这里提到的“洗脱期”是指在从 靶向治疗转换到免疫治疗时，需设置一段无治疗的时间段以清除靶向药物的残留，通常情况下是间隔 2 周左右，但具体 时间需参考前序药物的半衰期、临床研究经验、综合患者情 况进行个体化的调整，平衡治疗疗效和安全性。
6 特殊人群免疫治疗选择
免疫治疗作为现代医学领域极具突破性的治疗手段，在 肿瘤治疗方面展现出巨大潜力。然而，对于特殊人群而言， 其临床应用存在诸多特殊性与复杂性，需要更多的研究论 证。根据《ICIs特殊人群应用专家共识》中、英文版以及最新 版《ICIs 相关的毒性管理指南》，将特殊人群定义为三大类 （并存病、伴随用药、特殊临床条件等）十余小类[37-38] 。对于 这部分特殊人群的免疫治疗需要谨慎选择和密切关注。
目前多个研究证实接受免疫治疗的老年NSCLC患者队 列中，年龄≥65 岁和岁具有相同的疗效，且安全性良 好[39] 。而课题组前期研究发现[33，40] ：①≥75 岁患者的治疗获 益低于 75 岁以下患者，且治疗相关不良事件（treatmentrelated adverse event，TRAEs）发生率更高；②≥80岁患者接受 免疫治疗的疗效有限且 irAEs 发生率高，因此应谨慎使用 ICIs；③相对于年龄而言，PS 评分或合并症与免疫治疗疗效 更为相关。
有研究显示，肺纤维化、慢性阻塞性肺疾病等慢性肺病 的患者是免疫相关性肺炎的高危人群，这提示免疫治疗可能 不适用于伴有慢性肺病的肿瘤患者[41] 。同时孕妇也是一个 特殊人群，当前，绝大多数免疫治疗药物缺乏充足的针对孕 妇群体应用的安全性评估数据，因此，只有在全面权衡母体 疾病严重程度对孕妇生命构成的威胁以及对胎儿潜在影响 等多方面复杂因素后，才可能在极为特殊的情况下考虑使 用[42] 。此外，与正常人相比，有自身免疫性疾病的患者，其免 疫系统处于异常激活状态，在此基础上应用免疫治疗时，一 方面或许能增强对原发病灶（如肿瘤等）的治疗作用，但另一 方面，也极大地提高了免疫相关不良事件发生的概率，因此， 对于这一部分患者应根据具体情况慎用免疫治疗。
总之，许多特殊人群因为入组条件限制，常常被排除在 临床试验以外，缺乏临床疗效及安全性数据，因此，对于特殊 人群免疫治疗的研究需要更加深入和全面，进一步了解不同 特殊群体中各类免疫治疗的最佳适应证、禁忌证以及规范的 治疗流程，为临床实践提供更充实的依据。
7 其他临床问题
7.1 免疫联合化疗周期选择，4周期还是6周期
对于免疫治疗联合化疗的周期选择需要根据治疗目的 来决定。目前研究显示，新辅助免疫联合化疗3~4个周期比 2个周期的MPR率更高，但是超过5个周期的增加与更高的 MPR率无关[43] ，这提示对于免疫联合化疗的周期可能并不是 越长越好。此外，其他研究也显示，与晚期 NSCLC 患者的 3 或 4个周期免疫联合一线铂类药物的化疗相比，6个周期的 免疫联合化疗并没有提高总生存期[44] 。但是，对于这方面的 研究依然很少，相关结论还需要未来大量临床数据来佐证。
7.2 晚期NSCLC免疫维持治疗时间的争议
对于一线使用PD-1/PD-L1抑制剂满2年的晚期NSCLC 患者是否继续免疫治疗目前尚无定论。NCCN 指南建议免 疫维持治疗 2 年，但也有其他观点认为在患者有意向、没有 严重并发症和持续临床获益的前提下维持治疗可以持续 3 年甚至更长时间。而目前的相关研究发现接受固定持续时 间 2 年的 ICI 治疗患者与接受无限期 ICI 治疗患者在总体生 存率方面并没有存在差异，而在调整了吸烟、PD-L1状态和 组织学类型等协变量的多变量分析中，这一发现仍然稳 健[45] 。因此，对于大多数患者，2年 ICI治疗后可以考虑停止 治疗并密切监视。但对于一些特殊人群，2年可能并不是最 佳方案，可根据具体情况决定。
此外，完成2年ICI治疗后停药，如果后续疾病进展是否 可以再次重启免疫？NCCN 指南不推荐后线免疫治疗用于 前线免疫治疗中进展的患者，但并未对非因疾病进展停药的 患者提供相关建议。从 KEYNOTE 系列研究结果来看似乎 非因疾病进展停药的患者重启免疫治疗后仍有一定的临床 获益。因此，对于 2 年后非因疾病进展停药的患者，后续疾 病进展时可考虑重启免疫治疗。
8 结 语
综上所述，本文结合目前相关临床研究进展和循证学证 据，就NSCLC免疫治疗常见的7个临床问题进行了梳理和解 析，并提出了相应的应对策略。由于篇幅有限，还有其他很 多相关的临床问题没有囊括其中，包括：NSCLC免疫与放疗 的临床策略、NSCLC免疫不良反应与预后关系探讨、免疫治 疗耐药和不良事件监测生物标志物的研究进展、NSCLC 新 的免疫治疗药物治疗失败的原因等等。此外，本篇所提出的 临床问题和解决思路只是基于当前的临床研究和临床经验 获得，部分结论并没有标准答案，而部分结论未来还有很大 的讨论空间。因此，本课题组也期待未来有更多相关临床和 基础研究展开，为构建系统和规范化的 NSCLC 免疫治疗新 模式提供更有力保证。
