中国兽医学报杂志论文格式要求是什么?

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中国兽医学报杂志论文格式要求

　　题名

　　① 题名排版时左对齐;

　　② 题名应简明准确，一般不超过 20 个字;

　　③ 题名中常见的“……的研究、浅析、初探”等可删去。

　　作者

　　① 作者排序由作者在投稿时确定，投稿后一般不得改动;

　　② 作者姓名之间用逗号“，”隔开;

　　③ 不同单位作者按排序用阿拉伯数字上标标注;

　　④ 2 个字的姓名中间空一个字的空格;

　　⑤ 并列第 1 作者用上标的“△”标注，通讯作者用上标的“*”标注。

　　作者附属单位

　　① 作者及单位排版时右对齐;

　　② 作者单位通常只注录到二级单位，但重点实验室可注录，如：“吉林大学 动物医学学院 人兽共患病研究教育部重点实验室，吉林 长春 130062”;

　　③ 每个单位之间用分号“;”隔开。

　　中文摘要

　　① 建议用结构式摘要写法，概述研究的目的、方法、结果(包括主要数据)和结论;

　　② 一般不宜超过 500 字，如遇特殊需要字数可以略增加;

　　③ 不列图、表、公式，不引用文献，不加以评论和解释;

　　④ 不赘述本学科领域已成为常识的内容;

　　⑤ 采用第三人称的写法，不使用 “本文” 、 “作者” 等作为主语;

　　⑥ 除了公认公知的缩略语外，首次出现的英文缩写应加括号标注其全称。

　　关键词

　　① 一般 3～8 个，用分号“;”隔开;

　　② 不要用无实际意义的关键词如“研究、检测、分析”等;

　　③ 中、英文关键词应一一对应。

　　英文标题

　　① 英文标题排版时左对齐，只第一个单词的首字母大写其余均小写;

　　② 以往英文标题中流行的“A study on …., Study on…, Report on…, Research of …”等，目前 2 / 9不提倡使用，如：(Study) On negative influences of core periodicals;

　　③ 不影响语义的情况下尽量减少使用或不用冠词“a, the, an”;

　　④ 缩略语出现时，除非已公知公认，否则，应加括号注明全称。

　　英文作者信息

　　① 需要写出全部作者姓名，多个作者署名之间用逗号“，”隔开，姓的汉语拼音字母全部大写，名的第 1 个字母大写其余小写，如：ZHANG Tao，注意：2 个字的名不用“-”，应写成“GUOXiaodan”不是“GUO Xiao-dan”;

　　② 双姓氏应该写成 ZHUGE Liang (诸葛亮)，OUYANG Miaomiao (欧阳淼淼)。但台湾、香港等地的人名仍沿用韦氏拼音，如：蒋介石 CHIANG Kaishek;

　　③ “吕”姓的拼音统一为“LYU”，如：LYU Maomin;

　　④ 并列第 1 作者用上标的“△”标注，通讯作者用上标的“*”标注。

　　英文作者附属单位信息

　　① 小单位在前，大单位在后面，非省会城市要写到省，例如：Jiangsu Key Laboratory of Zoonosis,College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou, Jiangsu 116000, China;

　　② 注意山西的拼音为 Shanxi，而陕西为 Shaanxi。

　　英文摘要

　　① 英文摘要在内容上应与中文摘要保持一致，一般包括 4 部分内容如：objective, methods,results and conclusion;

　　② 常用第三人称，时态上特别是叙述方法时常用过去时;

　　③ 行文尽量简洁，动词与主语不要太离散，所以常用被动语态;

　　④ 英文摘要中不能出现“、”“。”“～”“——”“《 》”等中文标点符号。

　　引言或前言

　　① 前言主要概述研究的背景、目的、研究思路、理论依据等;

　　② 不应过多叙述同行熟知的背景知识，提及他人的研究成果时，需要引用参考文献;

　　③ 介绍本研究的情况时不用说明具体试验细节;

　　④ 引言中提及的内容不要和讨论部分雷同;

　　⑤ 未经检索，前言中不可写“国内外未曾报道”等字样，也不可自我评价“达到××水平”或“填补××空白”等;

　　⑥ 科技名词如有英文缩写，只第 1 次出现时标注英文名称及缩写或只标注缩写，以后均用英文缩写即可，不可一会儿用中文一会儿用英文缩写。同时科技名词表述要规范，如：“嗜碱性粒细胞”应为“嗜碱粒细胞”，“嗜酸性粒细胞”应为“嗜酸粒细胞”，“副粘病毒”应为“副黏病毒”等。

　　1 材料与方法

　　① 介绍论文的主要试剂时要写明试剂批号、厂家和纯度;

　　② 不同试剂之间用分号“;”隔开; 3 / 9

　　③ 介绍主要仪器时要写明仪器的厂家和型号;

　　④ 药品、试剂应使用化学名，并注明纯度、批号、生产单位;

　　⑤ 个人建立的方法应详细说明“方法”的细节，以备他人重复;

　　⑥ 改进的方法应详述改进之处，并以引用文献的方式给出原方法的出处;

　　⑦ 若论文涉及统计分析，应在该部分说明所采用统计分析软件的名称、版本和统计学方法，并说明统计学检验标准(P<0.05 或 P<0.01)。

　　统计学符号一律采用斜体并注意以下规范：a.样本的算术平均数用英文小写不用大写 X，也不用 Mean 或 M;平均数±标准差( ±s) 才是正确表达。b.标准差用英文小写 s，不用 SD;c.标准误用英文小写，不用写 SE;d.r检验用英文小写 r; e.F 检验用英文大写 F;f.关系系数用英文小写 r;g.样本数用英文小写 n;g.概率用英文大写 P，注意 P 值大写斜体“<” “>” 前后无空格，例如 P<0.001。

　　2 结果

　　① 应认真核对正文和图表的数据，达到准确、统一;

　　② 结果部分尽量不要简述相关方法及对结果进行评论，否则会造成结果与方法和讨论部分的内容重叠，显得累赘;

　　③ 结果中如涉及统计分析，在描述各组间相比较差异是否显著时要提供 P 值;

　　④ 结果中三线表及图片编排格式的具体要求见后文附图及附表。

　　3 讨论 讨论是论文的精华部分，在这部分应对结果进行深入分析，揭示事物的本质，把感性认识上升到理性认识。讨论部分的写作思路建议：

　　① 以研究结果为依据，提出令人信服的观点和见解。重点阐述所取得研究结果的创新性和实用价值。

　　② 论证所得结论和所提出假设的正确性。

　　③ 与国内外同类研究结果进行比较，对本研究作出恰当的评价。当论及他人的研究结果时，应客观、公正，可以提出自己的不同观点和意见。

　　④ 清楚地阐述结论，并提出每一结论的证据。

　　⑤ 对于研究结果存在的不足或缺陷，应当实事求是地评价和说明，并提出解决问题的办法及对今后研究工作的设想。参考文献作者首先要检查参考文献是否按论文中出现的先后顺序编码，且要一一对应。建议通过 Endnote 等软件注录参考文献。

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1.猪繁殖与呼吸综合征病毒环状 RNA疫苗的构建及环化条件优化

作者：陶春豪,黄颖,王振,姜一曈,朱鸿飞,贾红

作者单位：中国农业科学院;扬州大学

关键词：circRNA 疫苗;制备体系;PRRSV 疫苗;体外表达

　　摘要:为构建一种环化率高、便捷有效的环状 RNA(circRNA)疫苗制备体系,本研究采用基于Ⅰ型内含子的内含子外 显子置换(permutedintronexon,PIE)策略,构建了绿色荧光蛋白(EGFP)circRNA,并对体外转录后(IVT)、一次环 化后(IVC1)、二次环化后(IVC2)的 RNA 进行了circRNA 环化率的比较,在对circRNA 进行纯化后将构建的circRNA 体系应用于猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),基于 PRRSV GP5蛋白构建了2种circRNA,并进行了体外 表达评价。结果显示,IVC1RNA 与IVC2RNA 的 EGFPcircRNA 环化率及蛋白表达效果相近,但均显著优于IVT RNA,纯化后的 EGFPcircRNA 纯度可达74%,使用该制备体系构建的2种 PRRSVGP5蛋白circRNA 纯度分别为 71%与64%,Westernblot和间接免疫荧光结果显示2种circRNA 均成功表达。结果表明,成功构建了一种操作简 便、成本低廉且环化率高的circRNA 制备体系,并基于该体系制备了2种PRRSVGP5蛋白circRNA 候选疫苗,可实 现高效表达,从而为动物circRNA 疫苗开发及 PRRSV 新型候选疫苗的研制提供了理论依据。 

　　环状 RNA(circularRNA,circRNA)因其独特 的共价闭合环状结构和高度稳定性,近年来在 RNA 疫苗领域展现出巨大的应用潜力[1]。与线性 RNA 相比,天然的circRNA 大多为非编码 RNA,为单链 共价环状结构,不易被核酸酶降解,具有更长的半衰 期和更高的稳定性[2]。通过引入内部核糖体进入位 点(internalribosomeentrysite,IRES)作为翻译起 始元件,越来越多的工程化的环状 RNA 已被广泛 用于外源蛋白的表达[1]。与 mRNA 疫苗相比,circRNA 疫苗能诱导机体产生强大且持久的免疫反 应,且免疫原性低,这一特性已在非人灵长类动物中 得到初步验证[3]。此外,circRNA 在肿瘤治疗中也 极具应用潜力,其在机体持续表达抗原的优势使其 有望成为下一代药物的突破点[4]。

　　1992年,PUTTARAJU 等[5]首次提出了内含 子外显子置换(permutedintronexon,PIE)策略,利 用 T4噬菌体Ⅰ型内含子自剪接核酶的序列特点实 现了 RNA 体 外 环 化。2018 年,WESSELHOEFT 等[6]基于 PIE 策略,采用鱼腥藻Ⅰ型内含子,柯萨 奇病毒 B3(CVB3)IRES序列,并通过设计同源臂极 大的提高了环化效率与翻译效率。在circRNA 体 外合 成 过 程 中,主 要 存 在 3 种 RNA 产 物:线 性 RNA 前 体 (precursor RNA)、缺 刻 的 环 状 RNA (nickedRNA)以及circRNA,其中,前2种均为体 外环化时的副产物,会增加circRNA 疫苗的免疫原 性[7]。因 此,提 升 环 化 率 和 circRNA 纯 度 是 circRNA 疫苗制备过程中的核心任务。

　　猪繁殖与呼吸综合征(porcinereproductiveand respiratorysyndrome,PRRS)是严重危害养猪业的 传染性疾病[8]。疫苗是防控 PRRS的重要手段,然 而传统疫苗研发周期较长,且改良活病毒疫苗存在 安全性 问 题。猪 繁 殖 与 呼 吸 综 合 征 病 毒 (porcine reproductiveandrespiratorysyndrome,PRRSV)极 易发生重组与变异,导致 PRRSV 疫苗针对不同谱 系的毒株交叉保护效果不佳[9]。PRRSV GP5蛋白 上存在关键中和表位,是潜在的疫苗设计靶点[10]。 CUI等[11-12]开发了一种 PRRSV GP5蛋白 T 细胞 表 位 的 马 赛 克 DNA 候 选 疫 苗,针 对 多 种 不 同 PRRSV 毒株均可诱导强烈的细胞免疫反应。

　　RNA 疫苗具备安全性与有效性高、能快速开发 与生产、可进行人工设计等诸多优点,不仅在人类疫 苗领域取得了显著进展,在兽用疫苗领域也展现出 广阔的应用前景[13-14]。因此,本研究拟采用 PIE 策 略,构建一种circRNA 疫苗制备体系,同时将其应 用于 PRRSV,制 备 基 于 PRRSV GP5 蛋 白 的 circRNA 疫 苗,以 期 为 动 物 circRNA 疫 苗 开 发 及 PRRSV 新型候选疫苗研制提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 病毒与质粒

　　含EGFP基因的质粒pEGFP-N1及PRRSV 毒 株FZ16A(KY761966.1)的cDNA 核酸均由本实验 室保存;PRRSV GP5蛋白马赛克序列(mGP5)参照 文献[11]设计,由南京金斯瑞生物科技有限公司经 猪密码子优化后合成并克隆至质粒pcDNA3.1(+)- P2A-EGFP中,命 名 为 p3.1-mGP5;circRNA 载 体 质粒购自江苏耀海生物制药有限公司。

　　1.2 主要试剂

　　高 保 真 酶 PrimeSTAR?? HS、限 制 性 内 切 酶 BamH Ⅰ、Kpn Ⅰ、T4 DNA 连接酶、DH5α感受态 细胞均购自宝日医生物技术(北京)有限公司;HiScribe?? T7 HighYieldRNASynthesisKit、限制性 内切 酶 Spe Ⅰ-HF、Age Ⅰ-HF、T4 RNA Ligase ReactionBuffer均购自 NEB 公司;通用型 DNA 纯 化回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司; DnaseⅠ(1U/μL)、LipofectamineTM 3000Reagent 均购自 Thermo公司;7.5mol/L氯化锂购自中科瑞 泰(北 京)生 物 科 技 有 限 公 司;10 mmol/L GTP、 RnaseR 均购自苏州近岸蛋白质科技股份有限公 司;10×MOPS缓冲液、2×RNAloadingbuffer、Urea-PAGE凝胶 配 制 试 剂 盒、细 胞 裂 解 液、PMSF、 5×SDSPAGEloadingbuffer、牛血清白蛋白(BSA) 均购自碧云天生物公司;37%甲醛购自上海麦克林 生化科技股份有限公司;EGFPcircRNA 阳性对照 购自江苏耀海生物制药有限公司;PRRSV 高免血 清由本实验室保存;HRP标记的兔抗猪IgG 抗体、 AlexaFluor594标记的兔抗猪IgG 抗体、TritonX-100均购自北京索莱宝科技有限公司;ECL 化学发 光液购自上海天能生命科学有限公司;4%多聚甲醛 固定液购自北京雷根生物技术有限公司。

　　1.3 circRNA序列设计

　　由于circRNA 无需添加5'帽子结构、3'polyA 尾及非翻译区(UTR)序列,因 此 仅 在 开 放 阅 读 框 (ORF)上游引入 Kozak序列,其余元件为基于Ⅰ型 内含子 PIE策略构建circRNA 的常用元件且已包 含在circRNA 载体质粒中,E1与 E2代表外显子序 列(图1)。

　　1.4 重组质粒构建及线性化

　　1.4.1 目的基因扩增

　　设计扩增目的基因 EGFP、mGP5、GP5的特异性引物(表 1)。EGFP、mGP5、GP5 基因模板分别 为 pEGFP-N1、p3.1-mGP5、FZ16A 毒 株 cDNA。 PCR扩增体系:25μLPrimeSTAR?? HS,上、下游 引物(10μmol/L)各1μL,质粒模板1ng或cDNA 模板2μL,补ddH2O 至50μL。扩增条件:98 ℃变 性10s,60 ℃退火5s,72 ℃延伸45s,共35个循 环。PCR扩增后使用 DNA 纯化 回 收 试 剂 盒 进 行 PCR产物回收,按照说明书操作进行。

　　1.4.2 目的基因与载体双酶切

　　将1.4.1中获取的目的基因与circRNA 载体质 粒分别使用限制性内切酶 SpeⅠ与 AgeⅠ进行双酶 切。酶 切 体 系:10×rCutSmartTM Buffer10 μL, PCR产物或载体质粒5μg,SpeⅠ、AgeⅠ各5μL, 补充ddH2O 至100μL。37 ℃酶切5h。将酶切产 物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,随后对目的条带进行 胶回收,具体操作按照胶回收试剂盒说明书进行。

　　1.4.3 酶切产物连接、转化及鉴定

　　将酶切产物使用 T4 DNA 连接酶连接过夜,转 化 DH5α感受态细胞,筛选经质粒上的独一内切酶 BamHⅠ、KpnⅠ双酶切鉴定正确的阳性质粒送擎 科生物公司进行Sanger测序,验证重组质粒序列是 否正确。测序正确的重组质粒命名为 pcirc-EGFP、 pcirc-mGP5、pcirc-GP5。

　　1.4.4 重组质粒线性化

　　线性化酶切体系为:10×KBuffer10μL,重组质 粒20μg,BamHⅠ 10μL,补 充 ddH2O 至100μL。 30 ℃酶切5h。对酶切后的质粒进行电泳鉴定。

　　1.5 环状 RNA制备

　　1.5.1 体外转录(IVT)RNA 的制备

　　在无核酸酶的环境中配制IVT 体系:10×ReactionBuffer1.5μL、NTP各1.5μL、DTT1μL、线 性化质粒1μg、T7 RNA PolymeraseMix2μL,补 无核酸水至20μL。37℃反应16h。体外转录完成 后,向反应体系中加入 Dnase Ⅰ 2μL,37 ℃ 孵 育 15min,消化转录的 DNA 模板。将IVT 产物补无 核酸水至60μL,加入7.5mol/L 氯化锂30μL,混 匀后-20 ℃ 孵 育 30 min,4 ℃、16000×g 离 心 20min,弃上 清,使 用 70% 乙 醇 洗 涤 2 次,最 后 用 50μL无核酸水溶解 RNA 沉淀,得到纯化后的IVT RNA。

　　1.5.2 第1次环化(IVC1)RNA 的制备

　　IVT 产物纯化前,补无核酸水至 40μL,加 入 10mmol/LGTP10μL,55 ℃ 15 min进行环化反 应。随后按照1.5.1方法使用氯化锂进行 RNA 的 纯化,得到纯化后的IVC1RNA。

　　1.5.3 第2次环化(IVC2)RNA 的制备

　　取纯化后的IVC1RNA20μL,70 ℃ 5min解 开 RNA 二级结构,冰上3min。加入 T4RNALigaseReactionBuffer3μL、无核酸水1μL、10mmol/L GTP6μL,55 ℃ 8min进行环化反应。按照1.5.1 方法使用氯化锂进行 RNA 的纯化,得到纯化后的 IVC2RNA。最后使用 Nanodrop仪器检测制备好 的所有 RNA 的浓度。

　　1.5.4 RnaseR消化

　　取30μg 未消化的 circRNA,补 充 ddH2O 至 88.5μL。70 ℃ 5 min,冰上3 min。加入 RnaseR buffer10μL、RnaseR1.5μL,37 ℃消化15 min。 按照 RNA 纯化试剂盒 RNA Clean & ConcentratorTM-25说明书操作得到纯化后的circRNA。

　　1.6 甲醛变性凝胶电泳与4%尿素PAGE电泳

　　配制100mL1.2%甲醛变性胶:称取1.2g琼 脂糖,溶解于72mLDEPC 水中,高温加热溶解,室 温冷却至约60 ℃后于通风橱内加入10×MOPS缓 冲液10mL,37%甲醛18mL,核酸染料10μL,摇 匀后灌胶。配制10mL4%尿素 PAGE 胶:按照说 明书使用 Urea-PAGE凝胶配制试剂盒配制。制备 RNA 上样液:取1μgRNA,加入2×RNAloading buffer混合,70℃5min,冰上3min。电泳:甲醛变 性胶电泳 需 105 V 预 电 泳 15 min,RNA 点 样 后, 105V 电 泳 50 min;4% 尿 素 PAGE 电 泳 条 件 为 180V电泳30min,随后在核酸染料中泡染30min; 最后均置于凝胶成像仪中观察并拍照。使用Image J软件对电泳条带进行灰度分析,计算3种 RNA 的 占比。

　　1.7 circRNA体外转染

　　将293T 细胞接种于12孔板或48孔板,待细 胞密度长至 80% 左右,按照 LipofectamineTM 3000 说明书配制转染混合物,室温孵育10min后加入细 胞中,培养24或48h后观察荧光或收取蛋白进行 后续试验。对于 EGFP 荧光表达结果,使用Image J软件进一步计算平均荧光强度值。

　　1.8 Westernblot检测

　　GP5蛋白表达 将2种 PRRSV GP5circRNA 转染293T 细胞 24h后,弃去培养基,PBS洗涤2次,加入150μL细 胞裂解液和1.5μLPMSF,冰上10min裂解细胞; 4 ℃、12000×g 离心10min后收取蛋白上清;加入 5×SDSPAGEloadingbuffer,混匀后100 ℃变性 10min。将处理好的样本进行 SDS-PAGE 电泳,转 膜 后 使 用 5% 脱 脂 乳 室 温 封 闭 2h;封 闭 后 使 用 PRRSV 高免血清作为一抗(1∶1000)4 ℃孵育过 夜,TBST 洗膜3次;使用 HRP 标记的兔抗猪IgG 二抗(1∶10000)室温孵育1h,TBST 洗膜3次;最 后使用 ECL化学发光液显色观察结果。

　　1.9 间接免疫荧光(IFA)检测

　　GP5蛋白表达 将2种 PRRSV GP5circRNA 转染293T 细胞 48h后,弃去培养基,PBS洗涤2次;加入4%多聚 甲醛固定液室温固定15min,PBS洗涤3次;0.1% Triton-X-100通透10min,PBS 洗涤3次;1% BSA 室温封闭1h;使用 PRRSV 高免血清作为一抗(1∶ 500)4 ℃孵育过夜,PBS洗涤3次;使用 AlexaFluor594标记的兔抗猪IgG 二抗(1∶400)37 ℃避光 孵育1h,PBS洗涤3次;最后在荧光显微镜下观察 IFA 结果。 1.10 统计分析 采用 GraphPadPrism8.0 软件进行数据绘图 及统计分析,使用双尾配对t检验方法计算显著性 差异。

　　2 结果

　　2.1 EGFP重组质粒构建及线性化

　　未经酶切的 EGFP 重组质粒大部分为超螺旋 质粒,经 BamHⅠ单酶切后条带为4685bp,使用 BamHⅠ、KpnⅠ 双酶切后条带为 3050、1635bp (图2),与预期结果相符,且质粒经Sanger测序后条 带准确,证明重组质粒构建成功。EGFP重组质粒经 BamHⅠ单酶切线性化后条带与重组质粒 BamHⅠ 单酶切鉴定条带一致。

　　2.2 EGFPcircRNA制备体系的构建

　　2.2.1 环化流程的确定

　　对IVT RNA、IVC1RNA、IVC2RNA 均进行 了甲醛变性琼脂糖凝胶电泳及 4% 尿素 PAGE 电 泳。结果 显 示,甲 醛 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 可 有 效 分 离 precursorRNA,但 无 法 区 分 circRNA 与 nicked RNA(图3A);4% 尿素 PAGE 电泳能够清晰分离 nicked RNA,但 无 法 区 分 circRNA 与 precursor RNA,且电泳结果中可见环化后脱落的内含子片段 (图3B)。通过ImageJ软件对电泳条带进行灰度

分析,计算precursorRNA、nickedRNA 的比例,由 于 RNA 上样量均为1μg,因此可推算出circRNA 的比例,可知IVTRNA、IVC1RNA 和IVC2RNA 中circRNA 的 比 例 (环 化 率)分 别 为 18%、31%、 39%。 对IVT RNA、IVC1RNA、IVC2RNA 均进行 了体外转染。转染293T 细胞24、48h后分别观察 EGFP荧光表达情况,可见到IVTRNA 表达EGFP 的荧光亮度明显低于其他2种 RNA(图4A)。对平 均荧光强度值进行统计分析后,发现IVC1RNA、 IVC2RNA 转染后的 EGFP 表达水平无显著性差 异,但均显著高于IVT RNA 表达水平。综合考虑 环化率、蛋白表达效果、制备成本,选择制备IVC1 RNA 的流程作为后续制备circRNA 的方案。

　　2.2.2 EGFPcircRNA 纯化

　　将IVC1RNA 使用 RnaseR消化及柱纯化后, 回 收 得 到 纯 化 后 的 EGFPcircRNA。结 果 显 示, RnaseR消化后,precursorRNA 和nickedRNA 均 被有效消化,在电泳图中不可见(图5A、B),进一步 通过灰度分析计算,纯化后 EGFPcircRNA 的比例 (纯度)由纯化前的30%显著提高至74%(图5C)。

　　2.3 PRRSVGP5蛋白重组质粒构建及线性化

　　未经酶切的 pcirc-mGP5、pcirc-GP5 重 组 质 粒 大部分为超螺旋质粒,经 BamHⅠ单酶切后条带均 为4550bp,经 BamHⅠ、KpnⅠ双酶切后条带均为 3050、1500bp(图6),与预期结果相符,且质粒经 Sanger测序后条带准确,表明重组质粒构建成功。 重组质粒经 BamHⅠ单酶切线性化后,条带与重组 质粒 BamHⅠ单酶切鉴定条带一致,表明线性化效 果良好,可进行后续试验。

　　2.4 PRRSVGP5蛋白circRNA制备

　　通过体外转录制备得到IVC1RNA,随后使用 RNaseR 消化并纯化得到 mGP5circRNA 与 GP5 circRNA。经甲醛变性凝胶电泳(图7A)与4%尿素 PAGE电泳(图7B)对circRNA 纯度进行鉴定,通过 ImageJ软件对电泳条带进行灰度分析,结果显示, 制备的 mGP5circRNA 纯度为71%,GP5circRNA 纯度为64%(图7C)。结果表明,本研究建立的circRNA 制备体系能够高效纯化目标circRNA。

　　2.5 PRRSVGP5蛋白circRNA体外表达验证

　　mGP5circRNA 与 GP5circRNA 转染293T 细 胞后经 Westernblot验证可检测到特异性 GP5蛋 白表达(图8A),经IFA 验证可观察到 GP5蛋白与 其抗体结合后产生的红色荧光(图8B),结果表明, mGP5circRNA 与 GP5circRNA 成功在体外表达。

 

　　3 讨论

　　环状 RNA 疫苗作为一种新型 RNA 疫苗,除了 具备 mRNA 疫苗的优势(如安全性与有效性好、制 备成本低、制备周期短)外,还具备稳定性强、不易降 解、可持续表达抗原且表达的抗原免疫原性高等特 点,在传染病疫苗和肿瘤治疗领域极具前景[1]。然 而,当前circRNA 疫 苗 的 制 备 工 艺 仍 面 临 诸 多 挑 战,如何提高环化率及环状 RNA 纯度是影响环状 RNA 疫苗制备成本与免疫效果的关键因素。本研 究选择 了 基 于 Ⅰ 型 内 含 子 的 PIE 策 略 制 备 circRNA,该优化后的 PIE方法显著提高了circRNA的环化率[6]。通过对环化体系的系统研究与优化, 成功 构 建 了 circRNA 制 备 体 系,并 将 其 应 用 于 PRRSV,构建了 2 种 PRRSVcircRNA 疫苗,并完 成了体外表达鉴定。

　　在制备circRNA 的过程中,precursorRNA 和 nickedRNA 是常见的副产物。IVT 后的产物主要 是precursorRNA,但经过优化后的IVT 体系以及 利 用 Ⅰ 型 内 含 子 的 自 剪 接 特 性,部 分 precursor RNA 可发生自环化,使得IVT RNA 中存在 部 分 circRNA [3]。nickedRNA 是circRNA 环化位点断 裂而 形 成 的 缺 刻 RNA,因 此 在 各 个 环 节 制 备 的 RNA 中 均 有 存 在。 通 过 测 试 IVT RNA、IVC1 RNA、IVC2RNA 中3种 RNA 的比例以及蛋白表 达效果来确定最佳环化流程。由于3种 RNA 条带 大小接近且构象不同,因此很难将3种 RNA 准确 区分开[7]。有研究采用 Thermo公司的 E-Gel预制 琼脂糖凝胶电泳系统区分3种 RNA [6],也有研究通 过 LabChip ?? 电泳系统结合荧光定量 PCR来鉴定环 化率[15]。本研究采用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳与 4%尿素 PAGE 电泳结合的方法,通过灰度分析估 算circRNA 的比例,即环化率。其中电泳 Marker 为 DNA Marker,仅作为条带指示作用而不用于表 征 RNA 大小,并通过 EGFPcircRNA 阳性对照及 Sanger测序 验 证,确 定 构 建 的 EGFPcircRNA 正 确。结果 表 明 与 IVT RNA 相 比,经 过 环 化 后 的 RNA 无论环化率还是蛋白表达效果都得到了明显 的提升,而IVC2RNA 相比IVC1RNA 虽然环化率 及蛋白表达量都有一定提升但效果不明显,考虑到 二次环化的时间成本与试剂成本,最终选择了IVC1 RNA 作为最终的环化流程。

　　在小量制备circRNA 的实验室研究中,Rnase R是一种有效的circRNA 纯化工具。其核酸外切 酶活 性 可 以 消 化 大 部 分 precursor RNA、nicked RNA、脱落的内含子片段以及其他线性 RNA 副产 物。经过 RnaseR 消化,本研究成功将 EGFPcircRNA 的环化率从39%提高至74%。虽然高效液 相色谱(HPLC)可以进一步提高circRNA 纯度,但 其成本较高,通常用于大规模 RNA 纯化生产过程。

　　mRNA 疫苗在兽用疫苗领域已取得显著进展, 并 在 多 种 病 原 体 (如 猪 Delta 冠 状 病 毒 (PDCoV)[16],猪 流 行 性 腹 泻 病 毒 (PEDV )[17], PRRSV [18])展现出良好的应用效果。本研究将构 建的circRNA 制备体系应用于 PRRSV,针对本实 验室保存的 PRRSV 毒株 FZ16A GP5基因天然序 列制备了 GP5circRNA,Westernblot结果显示,表 达的 GP5蛋白可呈现2个条带,可能是由于 GP5蛋 白发生不同程度的糖基化造成的。另外还制备了一 种PRRSV GP5 蛋 白 马 赛 克 序 列 circRNA 疫 苗 (mGP5circRNA),mGP5circRNA 表 达 后 呈 现 单 一条带,由于发生糖基化而比理论上的 GP5蛋白略 大。2个circRNA 表达的 GP5蛋白条带略有差异 的原因可能是发生了不同程度的糖基化[19]。

　　本研究构建了纯度可达74%的circRNA 制备 体系,具有成本低、操作简便且无需特殊设备的优 点,适用于实验室circRNA 疫苗的前期制备与体外 表达筛选验证。在后续研究中可进一步探索不同的 纯化体系以提高circRNA 的纯度,并研究circRNA 的包封技术,从而使制备的circRNA 能应用于体内 试验。本研究采用的基于Ⅰ型内含子的 PIE 策略 具有较 高 的 环 化 率,未 来 还 可 探 索 其 他 高 效 circRNA 制 备 系 统,如 高 效 RNA 成 环 顺 式 剪 接 系 统[20]、Clean-PIE成环系统[21]以及Ⅱ型内含子 PIE 环化系统[22]等。此外,UTR 的使用,IRES 的筛选 与优化也是影响circRNA 蛋白表达的重要因素[23]。

　　综上所述,本研究成功构建了一种基于Ⅰ型内 含子 PIE 策略的 circRNA 制备体系,环 化 率 可 达 74%,并基于该体系制备了2种 PRRSV GP5蛋白 circRNA 疫苗并验证其能在体外高效表达,为动物 circRNA 疫苗开发与 PRRSV 新型候选疫苗的研制 提供了理论依据。