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1.猪繁殖与呼吸综合征病毒环状 RNA疫苗的构建及环化条件优化
作者：陶春豪,黄颖,王振,姜一曈,朱鸿飞,贾红
作者单位：中国农业科学院;扬州大学
关键词：circRNA 疫苗;制备体系;PRRSV 疫苗;体外表达
摘要:为构建一种环化率高、便捷有效的环状 RNA(circRNA)疫苗制备体系,本研究采用基于Ⅰ型内含子的内含子外 显子置换(permutedintronexon,PIE)策略,构建了绿色荧光蛋白(EGFP)circRNA,并对体外转录后(IVT)、一次环 化后(IVC1)、二次环化后(IVC2)的 RNA 进行了circRNA 环化率的比较,在对circRNA 进行纯化后将构建的circRNA 体系应用于猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),基于 PRRSV GP5蛋白构建了2种circRNA,并进行了体外 表达评价。结果显示,IVC1RNA 与IVC2RNA 的 EGFPcircRNA 环化率及蛋白表达效果相近,但均显著优于IVT RNA,纯化后的 EGFPcircRNA 纯度可达74%,使用该制备体系构建的2种 PRRSVGP5蛋白circRNA 纯度分别为 71%与64%,Westernblot和间接免疫荧光结果显示2种circRNA 均成功表达。结果表明,成功构建了一种操作简 便、成本低廉且环化率高的circRNA 制备体系,并基于该体系制备了2种PRRSVGP5蛋白circRNA 候选疫苗,可实 现高效表达,从而为动物circRNA 疫苗开发及 PRRSV 新型候选疫苗的研制提供了理论依据。
环状 RNA(circularRNA,circRNA)因其独特 的共价闭合环状结构和高度稳定性,近年来在 RNA 疫苗领域展现出巨大的应用潜力[1]。与线性 RNA 相比,天然的circRNA 大多为非编码 RNA,为单链 共价环状结构,不易被核酸酶降解,具有更长的半衰 期和更高的稳定性[2]。通过引入内部核糖体进入位 点(internalribosomeentrysite,IRES)作为翻译起 始元件,越来越多的工程化的环状 RNA 已被广泛 用于外源蛋白的表达[1]。与 mRNA 疫苗相比,circRNA 疫苗能诱导机体产生强大且持久的免疫反 应,且免疫原性低,这一特性已在非人灵长类动物中 得到初步验证[3]。此外,circRNA 在肿瘤治疗中也 极具应用潜力,其在机体持续表达抗原的优势使其 有望成为下一代药物的突破点[4]。
1992年,PUTTARAJU 等[5]首次提出了内含 子外显子置换(permutedintronexon,PIE)策略,利 用 T4噬菌体Ⅰ型内含子自剪接核酶的序列特点实 现了 RNA 体 外 环 化。2018 年,WESSELHOEFT 等[6]基于 PIE 策略,采用鱼腥藻Ⅰ型内含子,柯萨 奇病毒 B3(CVB3)IRES序列,并通过设计同源臂极 大的提高了环化效率与翻译效率。在circRNA 体 外合 成 过 程 中,主 要 存 在 3 种 RNA 产 物:线 性 RNA 前 体 (precursor RNA)、缺 刻 的 环 状 RNA (nickedRNA)以及circRNA,其中,前2种均为体 外环化时的副产物,会增加circRNA 疫苗的免疫原 性[7]。因 此,提 升 环 化 率 和 circRNA 纯 度 是 circRNA 疫苗制备过程中的核心任务。
猪繁殖与呼吸综合征(porcinereproductiveand respiratorysyndrome,PRRS)是严重危害养猪业的 传染性疾病[8]。疫苗是防控 PRRS的重要手段,然 而传统疫苗研发周期较长,且改良活病毒疫苗存在 安全性 问 题。猪 繁 殖 与 呼 吸 综 合 征 病 毒 (porcine reproductiveandrespiratorysyndrome,PRRSV)极 易发生重组与变异,导致 PRRSV 疫苗针对不同谱 系的毒株交叉保护效果不佳[9]。PRRSV GP5蛋白 上存在关键中和表位,是潜在的疫苗设计靶点[10]。 CUI等[11-12]开发了一种 PRRSV GP5蛋白 T 细胞 表 位 的 马 赛 克 DNA 候 选 疫 苗,针 对 多 种 不 同 PRRSV 毒株均可诱导强烈的细胞免疫反应。
RNA 疫苗具备安全性与有效性高、能快速开发 与生产、可进行人工设计等诸多优点,不仅在人类疫 苗领域取得了显著进展,在兽用疫苗领域也展现出 广阔的应用前景[13-14]。因此,本研究拟采用 PIE 策 略,构建一种circRNA 疫苗制备体系,同时将其应 用于 PRRSV,制 备 基 于 PRRSV GP5 蛋 白 的 circRNA 疫 苗,以 期 为 动 物 circRNA 疫 苗 开 发 及 PRRSV 新型候选疫苗研制提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 病毒与质粒
含EGFP基因的质粒pEGFP-N1及PRRSV 毒 株FZ16A(KY761966.1)的cDNA 核酸均由本实验 室保存;PRRSV GP5蛋白马赛克序列(mGP5)参照 文献[11]设计,由南京金斯瑞生物科技有限公司经 猪密码子优化后合成并克隆至质粒pcDNA3.1(+)- P2A-EGFP中,命 名 为 p3.1-mGP5;circRNA 载 体 质粒购自江苏耀海生物制药有限公司。
1.2 主要试剂
高 保 真 酶 PrimeSTAR?? HS、限 制 性 内 切 酶 BamH Ⅰ、Kpn Ⅰ、T4 DNA 连接酶、DH5α感受态 细胞均购自宝日医生物技术(北京)有限公司;HiScribe?? T7 HighYieldRNASynthesisKit、限制性 内切 酶 Spe Ⅰ-HF、Age Ⅰ-HF、T4 RNA Ligase ReactionBuffer均购自 NEB 公司;通用型 DNA 纯 化回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司; DnaseⅠ(1U/μL)、LipofectamineTM 3000Reagent 均购自 Thermo公司;7.5mol/L氯化锂购自中科瑞 泰(北 京)生 物 科 技 有 限 公 司;10 mmol/L GTP、 RnaseR 均购自苏州近岸蛋白质科技股份有限公 司;10×MOPS缓冲液、2×RNAloadingbuffer、Urea-PAGE凝胶 配 制 试 剂 盒、细 胞 裂 解 液、PMSF、 5×SDSPAGEloadingbuffer、牛血清白蛋白(BSA) 均购自碧云天生物公司;37%甲醛购自上海麦克林 生化科技股份有限公司;EGFPcircRNA 阳性对照 购自江苏耀海生物制药有限公司;PRRSV 高免血 清由本实验室保存;HRP标记的兔抗猪IgG 抗体、 AlexaFluor594标记的兔抗猪IgG 抗体、TritonX-100均购自北京索莱宝科技有限公司;ECL 化学发 光液购自上海天能生命科学有限公司;4%多聚甲醛 固定液购自北京雷根生物技术有限公司。
1.3 circRNA序列设计
由于circRNA 无需添加5'帽子结构、3'polyA 尾及非翻译区(UTR)序列,因 此 仅 在 开 放 阅 读 框 (ORF)上游引入 Kozak序列,其余元件为基于Ⅰ型 内含子 PIE策略构建circRNA 的常用元件且已包 含在circRNA 载体质粒中,E1与 E2代表外显子序 列(图1)。
1.4 重组质粒构建及线性化
1.4.1 目的基因扩增
设计扩增目的基因 EGFP、mGP5、GP5的特异性引物(表 1)。EGFP、mGP5、GP5 基因模板分别 为 pEGFP-N1、p3.1-mGP5、FZ16A 毒 株 cDNA。 PCR扩增体系:25μLPrimeSTAR?? HS,上、下游 引物(10μmol/L)各1μL,质粒模板1ng或cDNA 模板2μL,补ddH2O 至50μL。扩增条件:98 ℃变 性10s,60 ℃退火5s,72 ℃延伸45s,共35个循 环。PCR扩增后使用 DNA 纯化 回 收 试 剂 盒 进 行 PCR产物回收,按照说明书操作进行。
1.4.2 目的基因与载体双酶切
将1.4.1中获取的目的基因与circRNA 载体质 粒分别使用限制性内切酶 SpeⅠ与 AgeⅠ进行双酶 切。酶 切 体 系:10×rCutSmartTM Buffer10 μL, PCR产物或载体质粒5μg,SpeⅠ、AgeⅠ各5μL, 补充ddH2O 至100μL。37 ℃酶切5h。将酶切产 物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,随后对目的条带进行 胶回收,具体操作按照胶回收试剂盒说明书进行。
1.4.3 酶切产物连接、转化及鉴定
将酶切产物使用 T4 DNA 连接酶连接过夜,转 化 DH5α感受态细胞,筛选经质粒上的独一内切酶 BamHⅠ、KpnⅠ双酶切鉴定正确的阳性质粒送擎 科生物公司进行Sanger测序,验证重组质粒序列是 否正确。测序正确的重组质粒命名为 pcirc-EGFP、 pcirc-mGP5、pcirc-GP5。
1.4.4 重组质粒线性化
线性化酶切体系为:10×KBuffer10μL,重组质 粒20μg,BamHⅠ 10μL,补 充 ddH2O 至100μL。 30 ℃酶切5h。对酶切后的质粒进行电泳鉴定。
1.5 环状 RNA制备
1.5.1 体外转录(IVT)RNA 的制备
在无核酸酶的环境中配制IVT 体系:10×ReactionBuffer1.5μL、NTP各1.5μL、DTT1μL、线 性化质粒1μg、T7 RNA PolymeraseMix2μL,补 无核酸水至20μL。37℃反应16h。体外转录完成 后,向反应体系中加入 Dnase Ⅰ 2μL,37 ℃ 孵 育 15min,消化转录的 DNA 模板。将IVT 产物补无 核酸水至60μL,加入7.5mol/L 氯化锂30μL,混 匀后-20 ℃ 孵 育 30 min,4 ℃、16000×g 离 心 20min,弃上 清,使 用 70% 乙 醇 洗 涤 2 次,最 后 用 50μL无核酸水溶解 RNA 沉淀,得到纯化后的IVT RNA。
1.5.2 第1次环化(IVC1)RNA 的制备
IVT 产物纯化前,补无核酸水至 40μL,加 入 10mmol/LGTP10μL,55 ℃ 15 min进行环化反 应。随后按照1.5.1方法使用氯化锂进行 RNA 的 纯化,得到纯化后的IVC1RNA。
1.5.3 第2次环化(IVC2)RNA 的制备
取纯化后的IVC1RNA20μL,70 ℃ 5min解 开 RNA 二级结构,冰上3min。加入 T4RNALigaseReactionBuffer3μL、无核酸水1μL、10mmol/L GTP6μL,55 ℃ 8min进行环化反应。按照1.5.1 方法使用氯化锂进行 RNA 的纯化,得到纯化后的 IVC2RNA。最后使用 Nanodrop仪器检测制备好 的所有 RNA 的浓度。
1.5.4 RnaseR消化
取30μg 未消化的 circRNA,补 充 ddH2O 至 88.5μL。70 ℃ 5 min,冰上3 min。加入 RnaseR buffer10μL、RnaseR1.5μL,37 ℃消化15 min。 按照 RNA 纯化试剂盒 RNA Clean & ConcentratorTM-25说明书操作得到纯化后的circRNA。
1.6 甲醛变性凝胶电泳与4%尿素PAGE电泳
配制100mL1.2%甲醛变性胶:称取1.2g琼 脂糖,溶解于72mLDEPC 水中,高温加热溶解,室 温冷却至约60 ℃后于通风橱内加入10×MOPS缓 冲液10mL,37%甲醛18mL,核酸染料10μL,摇 匀后灌胶。配制10mL4%尿素 PAGE 胶:按照说 明书使用 Urea-PAGE凝胶配制试剂盒配制。制备 RNA 上样液:取1μgRNA,加入2×RNAloading buffer混合,70℃5min,冰上3min。电泳:甲醛变 性胶电泳 需 105 V 预 电 泳 15 min,RNA 点 样 后, 105V 电 泳 50 min;4% 尿 素 PAGE 电 泳 条 件 为 180V电泳30min,随后在核酸染料中泡染30min; 最后均置于凝胶成像仪中观察并拍照。使用Image J软件对电泳条带进行灰度分析,计算3种 RNA 的 占比。
1.7 circRNA体外转染
将293T 细胞接种于12孔板或48孔板,待细 胞密度长至 80% 左右,按照 LipofectamineTM 3000 说明书配制转染混合物,室温孵育10min后加入细 胞中,培养24或48h后观察荧光或收取蛋白进行 后续试验。对于 EGFP 荧光表达结果,使用Image J软件进一步计算平均荧光强度值。
1.8 Westernblot检测
GP5蛋白表达 将2种 PRRSV GP5circRNA 转染293T 细胞 24h后,弃去培养基,PBS洗涤2次,加入150μL细 胞裂解液和1.5μLPMSF,冰上10min裂解细胞; 4 ℃、12000×g 离心10min后收取蛋白上清;加入 5×SDSPAGEloadingbuffer,混匀后100 ℃变性 10min。将处理好的样本进行 SDS-PAGE 电泳,转 膜 后 使 用 5% 脱 脂 乳 室 温 封 闭 2h;封 闭 后 使 用 PRRSV 高免血清作为一抗(1∶1000)4 ℃孵育过 夜,TBST 洗膜3次;使用 HRP 标记的兔抗猪IgG 二抗(1∶10000)室温孵育1h,TBST 洗膜3次;最 后使用 ECL化学发光液显色观察结果。
1.9 间接免疫荧光(IFA)检测
GP5蛋白表达 将2种 PRRSV GP5circRNA 转染293T 细胞 48h后,弃去培养基,PBS洗涤2次;加入4%多聚 甲醛固定液室温固定15min,PBS洗涤3次;0.1% Triton-X-100通透10min,PBS 洗涤3次;1% BSA 室温封闭1h;使用 PRRSV 高免血清作为一抗(1∶ 500)4 ℃孵育过夜,PBS洗涤3次;使用 AlexaFluor594标记的兔抗猪IgG 二抗(1∶400)37 ℃避光 孵育1h,PBS洗涤3次;最后在荧光显微镜下观察 IFA 结果。 1.10 统计分析 采用 GraphPadPrism8.0 软件进行数据绘图 及统计分析,使用双尾配对t检验方法计算显著性 差异。
2 结果
2.1 EGFP重组质粒构建及线性化
未经酶切的 EGFP 重组质粒大部分为超螺旋 质粒,经 BamHⅠ单酶切后条带为4685bp,使用 BamHⅠ、KpnⅠ 双酶切后条带为 3050、1635bp (图2),与预期结果相符,且质粒经Sanger测序后条 带准确,证明重组质粒构建成功。EGFP重组质粒经 BamHⅠ单酶切线性化后条带与重组质粒 BamHⅠ 单酶切鉴定条带一致。
2.2 EGFPcircRNA制备体系的构建
2.2.1 环化流程的确定
对IVT RNA、IVC1RNA、IVC2RNA 均进行 了甲醛变性琼脂糖凝胶电泳及 4% 尿素 PAGE 电 泳。结果 显 示,甲 醛 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 可 有 效 分 离 precursorRNA,但 无 法 区 分 circRNA 与 nicked RNA(图3A);4% 尿素 PAGE 电泳能够清晰分离 nicked RNA,但 无 法 区 分 circRNA 与 precursor RNA,且电泳结果中可见环化后脱落的内含子片段 (图3B)。通过ImageJ软件对电泳条带进行灰度
分析,计算precursorRNA、nickedRNA 的比例,由 于 RNA 上样量均为1μg,因此可推算出circRNA 的比例,可知IVTRNA、IVC1RNA 和IVC2RNA 中circRNA 的 比 例 (环 化 率)分 别 为 18%、31%、 39%。 对IVT RNA、IVC1RNA、IVC2RNA 均进行 了体外转染。转染293T 细胞24、48h后分别观察 EGFP荧光表达情况,可见到IVTRNA 表达EGFP 的荧光亮度明显低于其他2种 RNA(图4A)。对平 均荧光强度值进行统计分析后,发现IVC1RNA、 IVC2RNA 转染后的 EGFP 表达水平无显著性差 异,但均显著高于IVT RNA 表达水平。综合考虑 环化率、蛋白表达效果、制备成本,选择制备IVC1 RNA 的流程作为后续制备circRNA 的方案。
2.2.2 EGFPcircRNA 纯化
将IVC1RNA 使用 RnaseR消化及柱纯化后, 回 收 得 到 纯 化 后 的 EGFPcircRNA。结 果 显 示, RnaseR消化后,precursorRNA 和nickedRNA 均 被有效消化,在电泳图中不可见(图5A、B),进一步 通过灰度分析计算,纯化后 EGFPcircRNA 的比例 (纯度)由纯化前的30%显著提高至74%(图5C)。
2.3 PRRSVGP5蛋白重组质粒构建及线性化
未经酶切的 pcirc-mGP5、pcirc-GP5 重 组 质 粒 大部分为超螺旋质粒,经 BamHⅠ单酶切后条带均 为4550bp,经 BamHⅠ、KpnⅠ双酶切后条带均为 3050、1500bp(图6),与预期结果相符,且质粒经 Sanger测序后条带准确,表明重组质粒构建成功。 重组质粒经 BamHⅠ单酶切线性化后,条带与重组 质粒 BamHⅠ单酶切鉴定条带一致,表明线性化效 果良好,可进行后续试验。
2.4 PRRSVGP5蛋白circRNA制备
通过体外转录制备得到IVC1RNA,随后使用 RNaseR 消化并纯化得到 mGP5circRNA 与 GP5 circRNA。经甲醛变性凝胶电泳(图7A)与4%尿素 PAGE电泳(图7B)对circRNA 纯度进行鉴定,通过 ImageJ软件对电泳条带进行灰度分析,结果显示, 制备的 mGP5circRNA 纯度为71%,GP5circRNA 纯度为64%(图7C)。结果表明,本研究建立的circRNA 制备体系能够高效纯化目标circRNA。
2.5 PRRSVGP5蛋白circRNA体外表达验证
mGP5circRNA 与 GP5circRNA 转染293T 细 胞后经 Westernblot验证可检测到特异性 GP5蛋 白表达(图8A),经IFA 验证可观察到 GP5蛋白与 其抗体结合后产生的红色荧光(图8B),结果表明, mGP5circRNA 与 GP5circRNA 成功在体外表达。
3 讨论
环状 RNA 疫苗作为一种新型 RNA 疫苗,除了 具备 mRNA 疫苗的优势(如安全性与有效性好、制 备成本低、制备周期短)外,还具备稳定性强、不易降 解、可持续表达抗原且表达的抗原免疫原性高等特 点,在传染病疫苗和肿瘤治疗领域极具前景[1]。然 而,当前circRNA 疫 苗 的 制 备 工 艺 仍 面 临 诸 多 挑 战,如何提高环化率及环状 RNA 纯度是影响环状 RNA 疫苗制备成本与免疫效果的关键因素。本研 究选择 了 基 于 Ⅰ 型 内 含 子 的 PIE 策 略 制 备 circRNA,该优化后的 PIE方法显著提高了circRNA的环化率[6]。通过对环化体系的系统研究与优化, 成功 构 建 了 circRNA 制 备 体 系,并 将 其 应 用 于 PRRSV,构建了 2 种 PRRSVcircRNA 疫苗,并完 成了体外表达鉴定。
在制备circRNA 的过程中,precursorRNA 和 nickedRNA 是常见的副产物。IVT 后的产物主要 是precursorRNA,但经过优化后的IVT 体系以及 利 用 Ⅰ 型 内 含 子 的 自 剪 接 特 性,部 分 precursor RNA 可发生自环化,使得IVT RNA 中存在 部 分 circRNA [3]。nickedRNA 是circRNA 环化位点断 裂而 形 成 的 缺 刻 RNA,因 此 在 各 个 环 节 制 备 的 RNA 中 均 有 存 在。 通 过 测 试 IVT RNA、IVC1 RNA、IVC2RNA 中3种 RNA 的比例以及蛋白表 达效果来确定最佳环化流程。由于3种 RNA 条带 大小接近且构象不同,因此很难将3种 RNA 准确 区分开[7]。有研究采用 Thermo公司的 E-Gel预制 琼脂糖凝胶电泳系统区分3种 RNA [6],也有研究通 过 LabChip ?? 电泳系统结合荧光定量 PCR来鉴定环 化率[15]。本研究采用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳与 4%尿素 PAGE 电泳结合的方法,通过灰度分析估 算circRNA 的比例,即环化率。其中电泳 Marker 为 DNA Marker,仅作为条带指示作用而不用于表 征 RNA 大小,并通过 EGFPcircRNA 阳性对照及 Sanger测序 验 证,确 定 构 建 的 EGFPcircRNA 正 确。结果 表 明 与 IVT RNA 相 比,经 过 环 化 后 的 RNA 无论环化率还是蛋白表达效果都得到了明显 的提升,而IVC2RNA 相比IVC1RNA 虽然环化率 及蛋白表达量都有一定提升但效果不明显,考虑到 二次环化的时间成本与试剂成本,最终选择了IVC1 RNA 作为最终的环化流程。
在小量制备circRNA 的实验室研究中,Rnase R是一种有效的circRNA 纯化工具。其核酸外切 酶活 性 可 以 消 化 大 部 分 precursor RNA、nicked RNA、脱落的内含子片段以及其他线性 RNA 副产 物。经过 RnaseR 消化,本研究成功将 EGFPcircRNA 的环化率从39%提高至74%。虽然高效液 相色谱(HPLC)可以进一步提高circRNA 纯度,但 其成本较高,通常用于大规模 RNA 纯化生产过程。
mRNA 疫苗在兽用疫苗领域已取得显著进展, 并 在 多 种 病 原 体 (如 猪 Delta 冠 状 病 毒 (PDCoV)[16],猪 流 行 性 腹 泻 病 毒 (PEDV )[17], PRRSV [18])展现出良好的应用效果。本研究将构 建的circRNA 制备体系应用于 PRRSV,针对本实 验室保存的 PRRSV 毒株 FZ16A GP5基因天然序 列制备了 GP5circRNA,Westernblot结果显示,表 达的 GP5蛋白可呈现2个条带,可能是由于 GP5蛋 白发生不同程度的糖基化造成的。另外还制备了一 种PRRSV GP5 蛋 白 马 赛 克 序 列 circRNA 疫 苗 (mGP5circRNA),mGP5circRNA 表 达 后 呈 现 单 一条带,由于发生糖基化而比理论上的 GP5蛋白略 大。2个circRNA 表达的 GP5蛋白条带略有差异 的原因可能是发生了不同程度的糖基化[19]。
本研究构建了纯度可达74%的circRNA 制备 体系,具有成本低、操作简便且无需特殊设备的优 点,适用于实验室circRNA 疫苗的前期制备与体外 表达筛选验证。在后续研究中可进一步探索不同的 纯化体系以提高circRNA 的纯度,并研究circRNA 的包封技术,从而使制备的circRNA 能应用于体内 试验。本研究采用的基于Ⅰ型内含子的 PIE 策略 具有较 高 的 环 化 率,未 来 还 可 探 索 其 他 高 效 circRNA 制 备 系 统,如 高 效 RNA 成 环 顺 式 剪 接 系 统[20]、Clean-PIE成环系统[21]以及Ⅱ型内含子 PIE 环化系统[22]等。此外,UTR 的使用,IRES 的筛选 与优化也是影响circRNA 蛋白表达的重要因素[23]。
综上所述,本研究成功构建了一种基于Ⅰ型内 含子 PIE 策略的 circRNA 制备体系,环 化 率 可 达 74%,并基于该体系制备了2种 PRRSV GP5蛋白 circRNA 疫苗并验证其能在体外高效表达,为动物 circRNA 疫苗开发与 PRRSV 新型候选疫苗的研制 提供了理论依据。
