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1.被子植物花粉包被研究进展
作者：袁炜蓉,刘剑镔, 廖海丽, 梁金清,吴俊
作者单位：湖南大学;杂交水稻全国重点实验室/湖南杂交水稻研究中心;湖南农业大学
关键词：花粉包被;绒毡层;拟南芥;水稻
摘要: 被子植物花粉包被位于花粉壁的最外层空腔中, 主要来源于绒毡层的分泌物以及绒毡层细胞在发 育晚期降解形成的残余物。花粉包被在防止花粉失水、保护花粉粒抵御病原菌侵害和机械损伤以及花 粉与柱头的相互识别中发挥重要作用。异常的花粉包被通常会导致结实率下降或雄性不育。本文描述 了被子植物花粉包被的形态、组成和功能, 综述了模式植物拟南芥和水稻的花粉包被突变体研究进展, 以期为花粉包被突变体在育种中的运用提供参考。
被子植物的繁殖具有高度选择性, 这种选择 性伴随着花粉和柱头结构细胞表面的多样性。成 熟的花粉粒受坚实的花粉壁保护, 内部含有一个 营养细胞和两个精细胞。花粉壁可分为三个主要 层, 花粉内壁、花粉外壁和花粉包被, 每个层的相 对数量因物种而异(Edlund 2004)。 花粉包被(pollen coat)是花粉表面物质的重要 组成部分, 位于花粉壁的最外层空腔中。在不同物 种中, 花粉包被有不同的名称, 又叫做花粉鞘(pollenkitt)、含油层(tryphine)等。花粉包被富含脂质和蛋白质, 主要来源于绒毡层的分泌物以及绒毡 层细胞在发育晚期降解形成的残余物(Jiang等 2013) 。花粉包被是被子植物发育所必需的, 在防 止花粉失水、保护花粉粒抵御病原菌侵害和机械 损伤以及花粉与柱头的相互识别中发挥重要作用 (Murphy等1998)。异常的花粉包被通常会使被子 植物花粉粘附和水合作用缺陷, 进而导致结实率 下降或雄性不育。
已有研究揭示了花粉壁前体的生物合成和转 运机制, 涉及绒毡层中的脂质、酚类和多糖代谢, 孢粉素前体的转运及其转录和表观遗传调节。而 控制花粉包被形成的调控机制仍然不清楚, 只有 少数参与后期表达的三萜和脂肪酸生物合成基因 和蛋白质特异性调节花粉包被的形成。花粉外壁 和花粉包被的结构、组成和功能具有物种特异性, 并与植物的传粉习性有关(Thien等2009)。与风力 传粉植物相比, 昆虫传粉植物的花粉包被的组成 成分更加丰富、在花粉粒中质量占比更高。目前 花粉包被的研究主要集中在以下三个方面: (1)鉴 定花粉包被完全缺失的突变体, 如拟南芥eceriferum突变体(Preuss等1993); (2)利用反向遗传学 和RNAi技术创制特定花粉包被蛋白质缺陷突变 体, 如拟南芥grp17突变体(Mayfield等2000); (3)通 过比较基因组学探索花粉包被相关的生物进化机 制(Fiebig等2000)。
目前杂交水稻的两系法制种仍需要可靠的环 境敏感型雄性不育系。绒毡层细胞中的自噬降解 对减数分裂后的水稻花药发育至关重要。绒毡层 退化后, 脂类和蛋白质残留物定位在花粉外壁空 腔中, 形成花粉包被, 最近已被证明在湿度适应中 发挥作用。水稻新型环境敏感型不育系——水稻 湿敏不育系, 其由于花粉包被组分缺失, 导致花粉 粒极易失水, 花粉粘附和水合作用缺陷, 这种缺陷 在高湿度条件下消失。研究花粉包被的形成和调 控机制, 阐明花粉与柱头的相互作用机理, 如自交 不亲和性反应和花粉水合作用等, 不仅可以揭示 植物重要生殖器官的遗传和分子基础, 同时将有 望发现作物杂交育种所需的优良雄性不育材料, 为新的两系杂交系统优化和抗逆作物品种的培育 提供遗传资源。
本文描述了被子植物花粉包被的形态、组成 和功能, 综述了模式植物拟南芥和水稻的花粉包 被突变体研究进展, 总结了花粉包被突变体形成 的分子机制及其生物学功能, 对花粉包被突变体 在作物杂种优势利用中的应用前景进行了展望。
1 花粉包被的形态、组成及功能
1.1 花粉包被的形态特征
被子植物的花粉包被形态因类群而异, 这种 形态的多样性决定了它们各自独特的传粉方式。 花粉包被的形态特异性是由它们各自不同的外壁 沉积模式所决定的, 花粉外壁是一种包含杆状体 (Ba)和顶盖(Te)的柱状结构(图1)。在以拟南芥为 代表的大多数昆虫授粉的花中(图1-A), 外壁顶盖 开放, 厚度约为1.25 μm, 花粉粒含有大量高密度、 分布相对均匀的花粉包被, 从而吸引昆虫进行传 粉。相反, 在以水稻为代表的大多数风媒花中(图 1-B), 外壁顶盖封闭, 厚度约为0.7 μm, 花粉粒含有 少量低密度、分布不均匀的花粉包被(Ariizumi等 2011)。而外壁结构介于这两种类型之间的植物物 种通常同时依靠昆虫传粉和风力传粉(Thien等 2009)。 绒毡层细胞位于花药壁四层孢子体中最内层, 与发育中的配子体直接接触, 包裹发育中的花粉, 成熟时细胞壁降解, 在花粉发育、孢粉素和花粉包 被的形成中起着重要作用。虽然外壁的孢粉素和 花粉包被成分都出现在绒毡层细胞中, 但它们沉 积和释放的时间不同: 孢粉素成分从完整的绒毡层 输出, 而花粉包被随着绒毡层细胞经历程序性细 胞死亡并释放其内容物而沉积(Quilichini等2015)。
在不同的被子植物类群中, 绒毡层存在不同 的细胞器分化。已有研究表明, 在拟南芥和水稻绒 毡层细胞中, 虽然大部分细胞器如细胞核、粗面内 质网、光滑内质网、高尔基体、线粒体、液泡、 小泡、自噬体等基本相同, 但仍存在少数细胞器分 化(Qiao等2023)。例如, 水稻中的乌氏体(Ubisch body)是在绒毡层细胞表面形成的、用于运输花粉 包被前体的分泌性脂质细胞器, 这在水稻、小麦等 禾本科物种中是特有的(Wang等2003; Li等2006)。 特异性分化的细胞器不仅可能与不同的花粉包被形态有关, 还可能涉及到花粉包被前体物质的合 成和转运, 值得进一步研究。
1.2 花粉包被的组成成分
花粉包被物质主要来源于绒毡层小体(tapetosomes)和油粒体(elaioplasts)这两种细胞器中的绒 毡层脂质体。绒毡层小体是一种富含脂质的结构, 含有油体蛋白(oleosin-like protiens), 在多种植物的 绒毡层细胞质中均有发现(Hernández-Pinzón等 1999)。油粒体起源于含有少量类囊体膜的质体, 且含有少量淀粉粒。目前已有研究表明, 花粉包被 的脂质成分同时来源于绒毡层小体和油粒体这两 种细胞器, 它们从绒毡层释放后, 其蛋白质和脂质 成分在最终转化为成熟花粉包被的过程中会经过 进一步的加工(Murphy等1998; Wu等1997), 这意味 着绒毡层小体和油粒体在花粉包被的形成中发挥 着协同作用, 对于花粉的成熟至关重要。
与富含孢粉素的花粉外壁相比, 花粉包被的 特征更明显, 其内容物更容易被提取、纯化及鉴定 (Doughty等1993)。花粉包被的化学分析已经揭示 了多种化合物的存在, 包括类胡萝卜素、类黄酮、 脂肪酸、类异戊二烯、糖复合物和许多其他化合 物(Hernández-Pinzón等1999)。此外, 花粉包被中 还包含了一系列的蛋白质和酶, 如T-油蛋白(Toleosins)、钙结合油蛋白(caleosins)、扩张蛋白(expansins)、阿拉伯半乳聚糖蛋白(arabinogalactan proteins)、花粉包被蛋白A类(pollen coat protein A-class, PCP-A)、花粉包被蛋白B类(pollen coat protein Bclass, PCP-B)、蛋白酶、脂肪酶、果胶酸裂解酶 和木聚糖酶等(Doughty等1998; Wang等2017)。脂 类及其衍生物也是花粉包被的重要组成部分, 包 括长链和超长链脂肪酸(C16-C34)、超长链烷烃(C23- C35)、超长链醇(C26和C28)、脂肪酸酯等(Yu等2019; Chen等2020)。三萜甾醇类, 如禾谷绒毡醇、菜油 甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇等, 以及酚酰胺类和黄酮 类, 如肉桂酸酰胺和山奈酚-3-O-槐糖苷等, 也在花 粉包被中被发现(Xue等2018; Fellenberg等2015; Rejón等2016) 。花粉包被的确切化学成分和功能 还有很多方面是未知的, 为了深入了解花粉包被的 组成及其在植物繁殖中的作用, 有待运用代谢组 学、蛋白质组学和分子生物学等方法进一步分析, 揭示花粉包被中代谢物的详细组成, 鉴定和分析 其中的蛋白质, 探究花粉包被形成和发育的分子 机制。
1.3 花粉包被的功能
1.3.1 渗透性和防护屏障
花粉粒的寿命通常以小时为单位, 花粉粒不 适应大量的水分流失, 它们的生存力往往因过度 脱水而受损。在传粉过程中, 花粉粒还需要经受住 从花药转移到亲和柱头过程的重重阻碍。虽然花 粉粒的含水量比其他植物组织低, 甚至表达一些 与脱水相关的基因, 但其外壁可以起到部分渗透 性的屏障作用, 以最大限度地减少脱水, 而花粉粒表面的疏水性花粉包被则进一步增强了这种保护 机制, 确保更高水平的防脱水保护。花粉包被的渗 透和防护功能是由其特定的组成成分实现的(Murphy 2006)。花粉包被含有的脂质呈半固体状态, 能 够起到防脱水作用并发挥部分渗透功能, 在花粉 与柱头接触过程中促进水分从柱头向花粉粒的转 移(Edlund 2004); 含有的类胡萝卜素和类黄酮醇苷 在高浓度下是有效的抗氧化剂, 在花粉粒运输到 柱头表面的过程中保护雄性配子体免受太阳辐射 的有害影响; 黄酮类化合物还具有抗病原体的特性, 能够抵御外来病原体的侵袭, 从而保护花粉粒免 受感染。这些成分的协同作用, 确保了花粉粒在从 花药到柱头的整个传输过程中的稳定性和活性。
1.3.2 花粉与柱头的粘附
花粉粒与柱头的粘附是开花植物授粉的第一 步, 这个过程由来自细胞壁的各种成分调控。在拟 南芥中的研究表明, 花粉与柱头细胞的初始结合 不依赖于花粉包被, 粘附分子存在于花粉的外壁 内, 且生化分析表明, 这种特异性、快速和无水的 粘附是由脂质相互作用介导的(Zinkl等1999)。脂 质花粉包被还可以作为携带和释放一系列有机挥 发性化合物的溶剂, 为潜在的昆虫媒介提供嗅觉 线索, 如C18多不饱和游离脂肪酸, 是有效的蜜蜂引 诱剂(Hopkins等1969)。花粉包被不仅能确保花粉 粘附在传播载体上, 还能使花粉相互粘附并形成 团块, 从而提高昆虫传粉效率。在花粉外壁介导的 粘附作用之后, 花粉包被发生移动, 导致脂质和蛋 白质混合, 花粉包被与柱头接触。现已有广泛的证 据表明, 花粉包被中的蛋白质和脂质, 以及柱头表 面的蛋白质, 也有助于粘附。第二阶段的粘附主要 依赖于蛋白质的相互作用, 如花粉包被蛋白和芸 薹属S位点相关蛋白(SLR1)之间的相互作用(Takayama等2000)。
1.3.3 水合反应
花粉在干燥柱头上的水合作用受到高度调节, 亲和花粉诱导柱头乳突细胞向外分泌出花粉水合 和萌发所需的水分和其他物质; 而不亲和花粉不 能诱导该分泌过程, 花粉的水合和萌发受到抑制, 因此, 水合成为干性柱头接受亲和花粉、排斥不亲 和花粉的一道屏障。大多数花粉粒从花药中释放 出来时, 代谢停止, 高度干燥, 含水量为15%~35% (Edlund 2004)。当花粉落在干燥柱头上时, 富含脂 质的花粉包被与柱头乳突细胞之间形成界面, 这 种界面可以促进水分渗透(Elleman等1986)。
花粉包被中富含脂质的基质的遗传和分子解 剖取得了很大进展。在拟南芥中, 花粉包被包含长 链和短链脂质以及蛋白质, 包括六种脂肪酶和八 种富含甘氨酸的油蛋白, 它们含有脂质结合结构 域(Mayfield等2001; Fiebig等2000)。破坏十字花科 植物的花粉包被脂质或花粉包被蛋白可以延迟或 阻止花粉水合作用(Doughty等1993)。特别是损害 长链脂质合成的突变, 影响花粉包被的正确合成, 从而严重影响拟南芥花粉的水合作用, 导致雄性 不育(Preuss等1993)。通过添加纯化的三酸甘油脂 可以恢复突变花粉的水合。具有湿润柱头的植物, 其富含脂质的柱头分泌物在功能上部分类似于花 粉包被, 能够促进花粉水合。
2 花粉包被突变体研究进展
花粉包被在被子植物生殖中扮演着至关重要 的角色, 其组成成分脂质和蛋白质对于花粉的正 常功能至关重要。脂质作为花粉壁的主要成分, 不 仅构成了花粉外壁的屏障, 保护花粉免受外界环 境的侵害, 还在花粉与柱头的相互识别中起着关 键作用。蛋白质则在花粉的发育和受精过程中发 挥着多种生物学功能。
过去, 由于花粉包被的分离技术较为复杂, 加 之蛋白质组分析技术的限制, 对花粉包被的研究 进展缓慢, 主要集中在模式植物拟南芥和水稻的 成熟花粉粒上。随着蛋白质组学技术的飞速进步, 研究人员开始利用液相色谱串联质谱法(LC-MS/ MS)等先进技术, 对花粉包被蛋白质组进行深入分 析, 揭示了花粉包被的复杂组成和功能(Wang等 2023)。
花粉包被突变体不仅改变了花粉包被的正常 功能, 而且对植物的繁殖过程产生了深远的影响。 在拟南芥和水稻这两种重要的模式植物中, 花粉 包被突变体的研究已经取得了显著进展。
2.1 拟南芥花粉包被突变体研究进展
拟南芥花粉包被在介导花粉粒与柱头的早期接触中起着至关重要的作用。它不仅在花粉粒开 裂后防止其过度失水, 而且有助于花粉粘附到柱 头上, 最重要的是, 促进水合作用(Edlund 2004)。拟 南芥花粉包被成分的分析和突变体研究揭示了花 粉包被是影响花粉与柱头相互作用的重要因素。
在拟南芥脂质代谢中, 绒毡层中的β-酮脂酰辅 酶A合成酶(β-ketoacyl-coenzyme A synthases, KCS) 参与脂肪酸延伸或超长链脂肪酸(very-long-chain fatty acids, VLCFAs)合成, 从而参与花粉包被脂质 的积累(Zhang等2021) 。在cer (eceriferum)突变体 中, 由于花粉包被中超长链脂质的缺失, 花粉不能 正常水合(Fiebig等2000; Preuss等1993)。拟南芥花 粉包被中最丰富的蛋白质GRP17, 它含有油蛋白结 构域且富含甘氨酸, 是快速启动柱头水合作用所必 需的, GRP17的突变延迟了花粉水化的开始, 降低 了突变花粉与野生型花粉的竞争能力(Mayfield等 2000, 2001)。花粉包被蛋白胞外脂肪酶4 (EXL4)缺 失突变体exl4-1的花粉水合速率降低, 在与野生型花 粉竞争时处于劣势, 研究表明EXL4可能与GRP17 协同作用, 通过改变花粉与柱头结合面的脂质组成, 从而促进水分向花粉的传递(Updegraff等2009)。
在拟南芥中, 越来越多的研究表明花粉包被 携带一系列蛋白质, 其中许多富含半胱氨酸的小 蛋白(cysteine-rich proteins, CRPs)被鉴定为花粉柱 头相互作用的重要调节因子。如PCP-Bs, 已被证 明通过介导花粉粒和柱头的细胞间通讯来调节拟 南芥的早期授粉(Wang等2017)。拟南芥PCP-B编 码基因, AtPCP-Bα (At5g61605)、AtPCP-Bβ (At2g29790)、AtPCP-Bγ (At2g16535)和AtPCP-Bδ (At2g16505), 在花粉发育的配子体晚期表达, 三缺突变 体pcpα/β/γ表现出水合速率显著降低、花粉管生长 延迟, 而花粉形态不受影响(Wang等2017)。PCPAs在芸薹属(Brassica)植物中发挥相同功能(Doughty等1998)。前期研究表明, PCP-Bs通过与柱头 快速碱化因子肽(RALF23/33)竞争, 结合拟南芥中 的ANJ-FER (ANJEA-FERONIA)受体激酶复合物, 从而降低柱头活性氧(ROS)水平, 促进花粉水合作 用(Liu等2021)。近期研究通过拟南芥柱头高量表 达的SD-RLK与花粉PCP-B相互作用筛选, 鉴定出 SD-RLK28直接与PCP-Bβ相互作用, 证实SD-RLK28正向调控花粉在柱头上的水合过程, 这一调控 作用并不是通过改变柱头ROS水平来实现的, 而是 通过直接与PCP-Bβ的相互作用来促进花粉水合 (Guo等2023)。
花粉包被中的信号蛋白, 特别是自交不亲和蛋 白同源物(self-incompatibility protein homologues, SPHs), 具有与CRPs相似的特征, 它们均含有较少 的半胱氨酸残基(Rajasekar等2019)。已有研究从 拟南芥花粉包被蛋白质组中鉴定出17个SPHs, 这 表明SPHs可能参与多种信号通路(Wang等2023)。 此外, 在拟南芥花粉包被中存在许多果胶相关酶, 如果胶酶、果胶酯酶、果胶裂解酶和果胶甲基酯 酶抑制剂(pectin methyl esterase inhibitors, PMEIs), 这些果胶相关酶的作用机制可能是通过修饰柱头 的细胞壁结构, 从而为花粉管的生长提供必要的 空间和条件, 这表明在授粉后萌发的第一阶段, 花 粉包被参与促进柱头细胞壁松动和促进花粉管延 伸(Wang等2023)。
在拟南芥花粉水合和花粉粘附调节因子的研 究领域, 已有研究揭示了拟南芥花粉包被衍生分 子在花粉水合过程中的关键作用, 而对来源于花 粉包被的花粉粘附调节因子知之甚少。已鉴别的 花粉包被蛋白虽然不是花粉包被特性的主要决定 因素, 但它们能够作为配体与许多柱头蛋白结合, 介导花粉粒与柱头的相互作用。
2.2 水稻花粉包被突变体研究进展
与拟南芥相比, 水稻花粉包被的脂质含量相 对较低, 在自然条件下, 水稻花粉在开花后仅有大 约5~10 min的时间保持较高的萌发力, 15 min后生 活力几乎全部丧失(Mayfield等2001; Dai等2006)。 这种短暂的存活期与花粉粒的含水量及其在传播 过程中的保水能力密切相关, 禾本科花粉粒含水 量高于十字花科花粉粒, 但易失水, 这使得禾本科 植物对环境湿度变化敏感。在相对湿度较低的环 境下, 水稻花粉粒对干燥敏感, 生活力丧失较快; 拟南芥花粉粒相对耐干燥, 生活力丧失缓慢。花粉 包被缺陷突变体是雄性不育的, 这种突变体在湿 度低于60%的环境中表现为花粉水合缺陷不育, 而 在湿度高于80%的环境中表现为完全可育, 称为湿 度敏感雄性不育(humidity-sensitive genic male ste-rility, HGMS) (Xue等2018)。
目前在水稻中已鉴别多个湿度敏感雄性不育 突变体, 并对其功能进行了表征。例如, 水稻hms1 突变体, 低湿度条件下花粉在柱头上的粘附作用 差, 导致结实率降低, 且在相对湿度时完全不 育, 但在相对湿度>75%时结实率恢复正常。HMS1 编码一个β-酮脂酰辅酶A合成酶, 催化了花粉包被 中的C26和C28超长链脂肪酸(VLCFAs)及其衍生物 的生物合成, 保护花粉免于脱水(Chen等2020)。水 稻湿度敏感雄性不育突变体osgl1-4, 可产生正常活 力的花粉, 但失水过快, 导致花粉粘附和水合的作 用缺陷, 结实率极低, 这种缺陷在相对湿度>80%条 件下消失。OsGL1-4主要在花粉和绒毡层细胞中 表达, 是合成长链烷烃所必需的, OsGL1-4突变导 致C25和C27烷烃的含量显著减少, 花粉包被异常(Yu 等2019)。OsCER1也参与极长链烷烃的生物合成, OsCER1敲除植物中VLC烷烃C25和C27含量降低, 过表达植物中C27烷烃含量增加。OsCER1表达下 调导致水稻不育, 绒毡层细胞中质体发育异常和 绒毡层细胞程序性死亡推迟, OsCER1敲除植株中 与花粉发育相关的基因表达水平显著改变(Ni等 2018)。这些研究表明, 超长链烷烃是水稻花粉包 被的组成成分, 通过影响花粉在不同环境湿度下 的粘附和水合作用来控制水稻雄性不育。
此外, 水稻三萜合酶ososc12/ospts1缺陷突变 体所产生花粉粒的花粉包被形成缺陷, 花粉包被 缺少3种主要脂肪酸, 棕榈酸和亚麻酸的含量明显 降低, 且完全缺少硬脂酸, 导致花粉粒得不到有效 保护而迅速失水。突变体ososc12/sspts1在相对湿 度的环境中表现为花粉水合缺陷不育, 而在 相对湿度>80%的环境中表现为完全可育(Xue等 2018)。三萜合酶OsOSC12将2,3-氧角鲨烯环化为 多种功能性类固醇和三萜类化合物, 它们是水稻 花粉包被的组成成分, 但这种三萜途径如何控制 花粉包被中脂肪酸的积累尚未可知。
3 展望
高等植物的花粉粒具有一层坚硬的花粉外壁, 内含一种叫做“花粉包被”的物质。花粉包被作为 花粉粒的最外层, 花粉包被在防止花粉粒干燥、保 护花粉粒免受机械损伤和病原菌侵染等方面起着 关键作用。在自然界中, 花粉包被发育不良和缺少 花粉包被的植株表现出育性明显下降。对花粉包 被发育的研究, 现已从微观观察发展到对发育过 程所涉及的分子和遗传过程的探索。
花粉包被的脂质和蛋白质可能协同作用促进 花粉与柱头的水合作用。在脂质通路中, 超长链脂 肪酸(VLCFAs)发挥重要作用。VLCFAs是通过丙 二酰酯酰载体蛋白(malonyl-acyl carrier protein)将 两个碳单位反复转移到C16和C18脂肪酸前体上而 合成的。在达到适当的长度后, VLCFAs会发生变 化, 生成烷、酯、伯醇和仲醇、醛和酮。CER有助 于VLCFA向C30的延伸, 这正是花粉层中含量最丰 富的酰基脂质。KCS是催化C16/C18延伸的限速酶, KCS催化的链长特异性影响雄性育性。在目前已 被鉴定的拟南芥和水稻花粉包被突变体中, 大多 数突变体是由于VLCFAs的减少或缺失导致花粉 包被异常, 从而导致雄性不育(表1)。VLCFAs介导 的花粉包被形成的机制可以保护水稻花粉免受低 湿度胁迫, 在杂交作物育种中具有潜在的用途。目 前对花粉包被的蛋白质通路了解不多, 很少花粉 包被蛋白被直接鉴定, 更少的花粉包被蛋白功能 被表征。但已有研究表明脂质结合油蛋白GRP在 花粉包被形成中可能具有重要作用。在十字花科 植物中, GRP的序列差异较大, 这可能与花粉包被 的多样化和物种形成有关(Mayfield等2001)。这些 发现强调了对花粉包被脂质和蛋白质相互作用及 其在植物繁殖中作用进行进一步研究的重要性。
花粉包被的形成与绒毡层的降解具有协同调 节作用, 并涉及到花粉与柱头之间的相互作用。花 粉包被的主要成分来源于绒毡层, 绒毡层细胞分 泌脂质花粉包被前体, 由ATP结合盒式(ATP binding cassette, ABC)转运蛋白转运, ABC转运蛋白参 与了花粉包被甾醇苷(steryl glycoside)或相关化合 物的沉积(Choi等2014)。花粉粘附后, 花粉包被的 脂质有助于在花粉和柱头之间建立水分梯度从而 促进水合作用, 而尽管目前对花粉包被脂质的合 成和绒毡层如何协助这一过程的机制尚不完全清 楚, 但已有研究表明, 特定的转录因子和基因表达 调控在绒毡层降解和花粉包被形成中起着关键作用。
例如, OsMS1作为转录激活因子, 参与调控绒 毡层的程序化降解和花粉外壁的形成, 这一过程 对花粉的正常发育至关重要(Yang等2019)。目前 研究主要表征与绒毡层降解相关转录因子的功能, 而特异性调节花粉包被形成的转录因子还没有在 拟南芥和水稻或任何其他植物物种中被鉴定。
花粉包被在不同类群植物中的差异可能主要 受到不同的生殖机制和进化历程的影响。拟南芥 和水稻作为双子叶植物和单子叶植物的代表, 它 们在花粉包被的形成和功能上存在差异, 主要表 现在以下几个方面: 花粉包被的组成和结构不同, 水稻花粉包被脂质含量相对较低, 这一特点可能 与其花粉的易失活特性密切相关(Zhao等2023); 花 粉包被功能有差异, 花粉包被的完整性对于拟南 芥花粉的萌发和花粉管的生长至关重要, 而在水 稻中, 花粉包被的特定组成成分, 如超长链脂肪酸 (VLCFAs), 对于花粉的粘附和水合作用具有重要 作用; 环境因素的影响, 水稻花粉对湿度的变化特 别敏感, 湿度敏感雄性不育(HGMS)现象在水稻中 较为常见, 而在拟南芥中则没有类似的报道。这表 明水稻花粉包被的适应性可能与特定的环境条件 有关, 而拟南芥则可能具有更广泛的适应性。
水稻湿度敏感型雄性不育(HGMS)的发现为 促进杂交种制种提供了新的途径。目前两系杂交 水稻主要利用光敏核不育系和温敏核不育系, 而 湿敏核不育系报道较少。水稻光/温敏核雄性不育 系的育性需要严格控制光照和温度, 极大地限制 了其应用范围, 而湿敏雄性不育系的育性只受扬 花期环境湿度的影响, 可在夏季干旱少雨的地区 配制杂种, 从而突破目前水稻杂种优势利用的地 域限制。水稻花粉包被缺陷突变体E157、osgl1- 4、Hms1和hms1i表现出对湿度敏感的基因雄性不 育性, 它们在开花期的高相对湿度(>80%)下容易 恢复育性, 为两系杂交育种系统提供了理想的材料。在最新的研究中, 漆小泉团队首次在玉米(Zea mays)和小麦(Triticum aestivum)中创制出湿度敏感 型雄性不育(HGMS)材料, 为玉米和小麦二系法杂 交育种提供了新的技术途径(Xiong等2024)。深入研 究花粉包被的组成及发育, 有助于挖掘新的HGMS 突变体, 培育新型湿敏雄性不育系, 对作物两系杂 交育种和杂种优势利用具有重要意义。
综上所述, 花粉包被的形成是一个复杂的过 程, 涉及脂质和蛋白质的协同作用、绒毡层的降解、 以及多种转录因子和基因的调控。花粉包被在不 同植物类群中的多样性和特异性对于植物的生殖 成功至关重要, 同时也为农业生产中的作物改良 提供了重要的遗传资源。未来的研究需要综合考 虑这些因素, 以更全面地理解花粉包被, 并为作物 育种提供理论基础和技术支持。
2.农杆菌介导工业大麻茎尖遗传转化体系的建立与优化
作者：张园,郭孟璧, 许艳萍, 吕品, 袁行,杨若菡,郭蓉,杨明,周楠, 陈璇
作者单位：云南省农业科学院;西双版纳傣族自治州农业科学研究所
关键词：工业大麻;茎尖;遗传转化;参数优化;GUS组织化学染色
摘要: 本研究以根癌农杆菌(GV3101)介导遗传转化实验, 转化含有GUS标记基因的pBI121载体至工业大 麻‘云麻7号’, 并通过筛选卡那霉素浓度、农杆菌浓度、侵染时间、真空渗透时间、共培养时间等影响因 素, 建立了基于工业大麻品种‘云麻7号’茎尖的遗传转化体系。本文发现以1.0 cm长的7日龄幼苗茎尖为 外植体, 用MS液体培养基(MS+5%蔗糖+0.025% Silwet L-77+150 μmol·L–1 乙酰丁香酮, pH 5.6)悬浮菌体至 OD600为0.5, 侵染茎尖40 min (其中真空值0.04 MPa下渗透处理20~25 min), 19°C避光条件下共培养48 h, 茎 尖在抗性筛选培养基(WPM+3.0%蔗糖+0.50 g·L–1 天冬酰胺+0.50 g·L–1 谷氨酰胺+4.0~5.0 g·L–1 植物凝胶+ 200 mg·L–1 羧苄青霉素+200 mg·L–1 头孢霉素+75 mg·L–1 卡那霉素, pH 5.6~5.8)中诱导芽伸长, 最终继代至 生根培养基(WPM+3.0%蔗糖+0.50 g·L–1 天冬酰胺+0.50 g·L–1 谷氨酰胺+4.0~5.0 g·L–1 植物凝胶+200 mg·L–1 羧苄青霉素/头孢霉素+0.05% PPM, pH 5.6~5.8)中诱导生根。抗性植株经PCR及GUS组织化学染色检测, 最终获得转GUS标记基因的工业大麻阳性植株。
大麻(Cannabis sativa)为大麻科(Cannabinaceae)大麻属一年生植物, 起源于中国, 是中国的传统 作物, 在我国具有几千年的种植和利用历史, 目前 在内蒙古、黑龙江、甘肃、山西、陕西、安徽、 广西、贵州、云南、四川等地均有分布。大麻传 统利用主要以纤维应用为主, 目前已拓展到纤维 用、籽用、药用和秆用等多个领域。大麻以纤维 束纺纱, 在纺织中具有极高的价值, 加入大麻纤维 的纺织品具有明显的透气、吸汗和抑菌的作用, 穿 着舒适, 被称作“既有亚麻纺织品的风格, 又具有羊 毛制品的舒适感” (高志勇和张万海2006)。大麻的 种子作为传统的中药“火麻仁”, 具有润肠通便的作 用; 现代研究也证明, 大麻籽油具有降低胆固醇、 降血压、抗氧化、清除人体内自由基的作用(何锦 风等2008; 关枫等2024; 张云云等2012)。此外, 大 麻种子中含有的亚油酸和亚麻酸比例近乎3:1, 非常 适合于进行面霜类产品的开发(Oomah等2002)。 近年来, 人们对大麻中的各类药用化合物给予了高 度的关注, 特别是大麻素类化合物大麻二酚(cannabidiol, CBD), 该化合物为四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol, THC)的同分异构体, 但不同于THC的 一点是, CBD不会产生精神依赖性, 又具有止痛、 抗炎、缓解焦虑、镇静等作用, 是开发治疗癫痫、 抑郁症、帕金森症、癌症等疾病相关的新药所需 要的重要原料(Koppel等2014; DeGasperis等2020; Ferber等2020; 粟建光等2019; Noreen等2018; Peng 等2022)。此外, 大麻二酚还具有潜在的进行毒品 戒断的作用(Ren等2009)。
通过研究大麻的纤维素、蛋白质、油脂成分 及次生代谢等化合物的合成和调控途径, 探索各 种合成途径中关键基因的功能等, 有利于我们针 对性筛选不同用途的大麻品种, 如高油品种、高蛋 白品种、高CBD药用型品种等。而高效稳定的大 麻遗传转化体系的建立为解析大麻重要性状基因 的功能及代谢途径的分子机制提供有力的帮助。 目前, 应用于大麻的遗传转化技术主要还是基于 农杆菌介导的方法进行。该遗传转化过程一般通 过2种途径实现, 一种是如Mackinnon等(2000)、 Galán-Ávila等(2021)不需要经过脱分化途径诱导 愈伤组织, 直接对茎尖和下胚轴等组织材料进行侵 染, 并诱导生根, 获得完整的转基因植株; 另外一种 则是通过脱分化和再分化途径诱导愈伤组织, 如 Zhang等(2021)通过侵染下胚轴诱导愈伤组织, 再 分化获得胚性细胞, 通过细胞全能性诱导胚性细 胞发育成再生植株以获得完整的转基因材料。第 一种途径可有效避免工业大麻遗传转化过程中受 基因型限制的问题, 且转化周期更短, 但无细胞系 形成, 无法大量获得转基因株系; 而第二种途径则 受基因型限制严重, 如Feeney和Punja (2003)仅在 细胞系中获得了稳定遗传, 未能最终获得再生植株;Zhang等(2021)测试了100种不同基因型的大麻材 料, 仅从中筛选出1个再生效率为7.09%的材料。
本研究以低纬度地区主栽工业大麻品种‘云麻 7号’茎尖直接作为遗传转化的外植体并诱导生根, 通过对遗传转化各关键环节进行优化, 提高转化 效率, 缩短转化周期, 最终获得转基因植株, 为后 期进行工业大麻的基因功能验证提供良好的技术 平台。
1 材料与方法
1.1 供试材料与试剂
本研究中所用的供试材料受体为‘云麻7号’种 子(Cannabis sativa L.)在MS培养基中生长7 d的无 菌苗幼嫩茎尖。根癌农杆菌GV3101、质粒载体 pBI121购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司。 本研究所需培养基见表1, 配制完成后均在121°C 下灭菌20 min。
1.2 试验方法
1.2.1 供试材料的无菌处理及培养
选取饱满完整的‘云麻7号’种子, 用加入0.1% (V/V) Tween-20的10% (V/V)次氯酸钠(有效氯含量 为0.5%)溶液进行表面消毒20 min, 期间摇晃数次; 然后以无菌水清洗5~6遍后, 再用加入400 mg·L–1 Carb的无菌水处理20 min, 以无菌水清洗5~6遍, 晾 干种子表面水分, 最终接种至MS培养基(含3%蔗 糖及0.5%植物凝胶, pH 5.8)中待种子萌发。(25± 2)°C下暗培养, 待7 d后取1 cm左右的茎尖备用。
1.2.2 农杆菌菌液的制备
将质粒pBI121经冻融法转化至农杆菌GV3101 感受态, 涂布于YEP固体培养基(表1), 挑取单克隆 进行PCR阳性鉴定, 并接种于5 mL的YEP液体培养 基(表1), 放置摇床中28°C、200 rpm过夜培养, 再 取200 μL该菌液接种至50 mL新鲜的YEP液体培养 基, 28°C、200 rpm振荡培养10 h后, 6 000×g离心5 min收集菌体, 用农杆菌侵染液清洗菌体1次, 并重 悬浮菌体调节OD600值以备用。
1.2.3 遗传转化参数的确定
在超净工作台上, 切取1 cm左右的工业大麻无 菌苗茎尖, 置于50 mL无菌离心管中, 然后加入侵 染液(含AS, 表1)浸泡大麻茎尖, 在不同真空压下渗 透10~40 min, 并在恒温摇床慢速摇至总侵染时间 为40 min, 再去除菌液, 在无菌滤纸上吸干茎尖表 面残留菌液, 接种于共培养基, 于19°C暗处共培养, 选取部分经共培养的茎尖, 进行GUS瞬时表达率 统计, 以确定最佳转化条件。农杆菌浓度: 用活化 好的不同OD600值的根癌农杆菌菌液(OD600分别为 0.1、0.3、0.5、0.8和1.0)侵染大麻茎尖, 再接种至 共培养基, 置于19°C暗处培养3 d。取共培养结束后 的茎尖进行组织化学染色, 统计GUS瞬时表达率。
卡那霉素浓度: 7日龄工业大麻离体茎尖, 接种 于添加卡那霉素0、25、50、75、100及150 mg·L–1 的WPM培养基, 25°C培养7及15 d。每个处理培养 约50个茎尖, 重复3次。经筛选后统计外植体的存 活率及生根率, 以确定适宜的卡那霉素浓度。
农杆菌侵染时间: 将根癌农杆菌调节至OD600 值为1.0, 侵染外植体的时间分别设定为5、10、15、 20、30和40 min, 侵染完成后将受体材料接种至共 培养基上置于19°C暗处培养3 d。取共培养结束后 的茎尖进行GUS组织化学染色, 统计GUS瞬时表 达率。
真空渗透时间: 将根癌农杆菌调节至OD600值 为1.0, 外植体受农杆菌侵染的时间设置为40 min, 同时加入真空渗透处理, 真空渗透时间分别设定 为40、30、25、20、15和10 min (不足40 min的以 常压侵染的方式补齐时间至40 min), 处理完成后, 将受体材料接种至共培养基上置于19°C暗处培养 3 d。取共培养结束后的茎尖进行GUS组织化学染 色, 统计GUS瞬时表达率及外植体死亡率。
共培养时间的确定: 将根癌农杆菌调节至 OD600值为1.0, 侵染茎尖, 转移至添加AS的共培养 基中分别培养1、2、3、4和5 d, 取共培养结束后的 茎尖进行组织化学染色, 统计GUS瞬时表达率。
1.2.4 GUS组织化学染色
共培养后, 每个处理随机取10~20个茎尖, 无 菌水清洗5~6遍, 去除表面农杆菌后, 用无菌滤纸 吸干茎尖表面多余水分, 放入1.5 mL离心管中, 加 入GUS组织化学染色液(即用型染色液, 北京索莱 宝科技有限公司), 37°C恒温过夜, 观测统计GUS瞬 时表达率, 以无菌水清洗的未侵染茎尖为阴性对 照。GUS瞬时表达率(%)=显色的组织数/检测总样 本数×100, 每个不同参数处理下的检测试验均重 复3次。
1.2.5 转基因抗性植株的获得
将共培养后的茎尖, 经含有羧苄青霉素(200 mg·L–1 ) 的无菌水清洗5~6遍, 用无菌滤纸吸干茎尖 表面水分, 置于筛选培养基上筛选抗性茎尖, 然后 将抗性茎尖继代在生根筛选培养基上诱导生根, 获得转基因抗性植株。
1.2.6 转基因植株的分子鉴定
用CTAB法提取抗性植株的总DNA。以质粒 pBI121的DNA为阳性对照, 以未转基因工业大麻 植株为阴性对照。设计新霉素磷酸转移酶编码基 因(nptⅡ)特异引物KanF1: 5′-CACTGAAGCGGGAAGGGACT-3′, KanR1: 5′-CGATACCGTAAAGCACGAGGAA-3′, 扩增片段长度为512 bp, 扩增程 序: 94°C 5 min; 94°C 30 s, 52°C 30 s, 72°C 1 min, 32个循环; 72°C 10 min。扩增产物经10 g·L–1 琼脂 糖凝胶电泳, 在凝胶成像系统下观察拍照。
1.3 数据处理
用Excel 2016进行数据处理与分析, 数据以平 均数±标准差表示; SPSS软件进行显著性分析。
2 实验结果
2.1 工业大麻茎尖遗传转化效率的影响因素
2.1.1 工业大麻茎尖对卡那霉素的抗性
在筛选培养过程中, 随着卡那霉素质量浓度 提高, 茎尖再生分化出新的芽点的能力逐渐降低, 且再生芽呈现黄化或白化直至死亡(图1), 其存活 率逐渐降低, 且随着卡那霉素的加入, 茎尖根系再 生能力严重下降(图2)。当卡那霉素浓度达到75 mg·L–1 时, 再生芽存活率仅有8.4% (表2)。因此, 后 期设定抗性筛选培养基中的卡那霉素筛选浓度为 75 mg·L–1 较为适宜; 但培养基卡那霉素的加入严 重影响再生芽的根系生长, 故后期筛选出抗性再 生芽后, 需转接至无卡那霉素抗性的生根培养基 中诱导生根。
2.1.2 农杆菌浓度
在农杆菌侵染过程中, 随着菌液浓度(OD600) 提高, GUS瞬时表达率出现先上升后降低趋势, 当 菌体浓度为OD600=0.5时, GUS瞬时表达率达到 11.67% (图3), 菌液浓度OD600=0.8时, GUS瞬时表 达率增长至12.03%, 但增幅不明显。为避免后期 外植体筛选培养过程中农杆菌过度生长, 导致污 染率增加的情况, 选择OD600为0.5作为农杆菌侵染 液最佳浓度。
2.1.3 农杆菌悬浮液侵染时间
在农杆菌侵染过程中, 随着侵染时间的增加, GUS瞬时表达率呈现逐渐升高的趋势, 当农杆菌侵 染40 min时, GUS瞬时表达率为最大值, 达14.13% (图4); 但同时可观察到, 农杆菌侵染时间达到20 min后, 随着侵染时间的增加, GUS瞬时表达率无 显著增加的趋势。
2.1.4 真空渗透时间
结合正常大气压条件下不同侵染时间对遗传转化效率的影响结果,
研究在侵染时间40 min条件 下真空渗透处理对遗传转化效率的影响。我们发 现, 经过–0.06 MPa的真空渗透处理后, 可一定程度 上提高遗传转化效率, 当处理时间达到25 min时, 转化效率可达到19.88%, 之后随着处理时间的增 加, 转化效率无明显增加; 同时, 过长时间的真空 处理对幼嫩的外植体伤害较大, 处理时间为25 min 时, 幼嫩外植体死亡率已达10.56%。故而, 在进行真空渗透处理增加农杆菌侵染的遗传转化效率时, 选择真空渗透处理20或25 min均较为适宜(图5)。
2.1.5 共培养时间
侵染结束后, 将工业大麻幼嫩茎尖与农杆菌 在19°C黑暗环境下共培养, 以增加农杆菌将外源 基因整合到植物基因组的效率。当共培养时间在 2~3 d之间, 均能获得较高的转化效率, 但随着共培 养时间的增加, 转化效率反而下降, 这可能是农杆 菌过度生长所致。由于共培养2和3 d的转化效率 差别不明显, 故最终选择共培养最佳时间为2 d, 以 获得较高的转化效率, 同时也降低了后期筛选培 养基中农杆菌过度生长的可能(图6)。
2.2 转基因植株检测
2.2.1 转基因植株GUS组织化学染色及PCR鉴定
取7日龄无菌苗茎尖进行农杆菌介导的遗传 转化, 待共培养48 h后, 将茎尖组织用含羧苄青霉 素(500 mg·L–1 )的无菌水清洗后, 进行GUS组织化 学染色, 可见阴性对照并无蓝色出现(图7-A), 而经 遗传转化pBI121质粒的部分茎尖在再生芽生长点 呈现蓝色(图7-B); 同时部分茎尖接种至生根筛选 培养基中诱导抗性植株, 30 d后, 将植株进行GUS染色检测后呈现蓝色, 抗性植株中gus基因的表达 可说明外源基因在大麻中成功转化并稳定表达(图 7-C~E)。 将在抗性筛选培养基上生长出的绿色植株进 行取样, 提取总DNA后, 进行Kan标记的PCR扩增, 发现所取的31株材料中, 有26株抗性植株可扩增 出目的片段(图8)。
2.2.2 转基因体系的建立
取7日龄无菌苗(图9-A), 进行农杆菌介导的遗 传转化(图9-B), 待共培养48 h后(图9-C), 将茎尖组 织用含羧苄青霉素(500 mg·L–1 )的无菌水清洗, 吸 干水分后接种至抗性筛选培养基中诱导再生芽(图 9-D), 并进一步继代至生根筛选培养基中诱导生根 (图9-E和F), 选取生长状态良好、根系较壮的再生 植株进行鉴定(图9-G), 将阳性植株炼苗3~5 d, 移 栽至水培箱中壮苗(图9-H), 然后移栽至营养盆中 (图9-I), 最终获得15株转基因大麻完整植株。
3 讨论
目前, 工业大麻的分子机制功能解析工作的深 入程度还不够, 其主要的制约因素还是遗传转化 技术体系的不成熟。通过农杆菌介导的侵染工业 大麻胚性愈伤组织以获得转基因植株的方法, 受 基因型影响明显, 目前仅在Zhang等(2021)所使用 的‘云麻7号’和‘Red Cherry Berry’的杂交F2代DMG278中实现。茎尖转化法虽然存在假阳性率高、转 化效率较低、嵌合体较多、遗传不稳定等不利因 素(肖荣等2022), 但因其不受基因型限制, 转化周 期短等优点, 仍然在不少植物遗传转化困难的植 物中被广泛使用。本研究以工业大麻无菌苗茎尖 为外植体, 通过探索卡那霉素筛选浓度、优化侵染 时间和侵染方法、筛选侵染菌体浓度和共培养时 间等, 并结合真空渗透侵染法(Deguchi等2020), 确 立了最佳转化参数为菌液浓度OD600为0.5, 侵染时 间40 min (含真空渗透处理25 min), 19°C下共培养 48 h, 抗性筛选培养基中卡那霉素筛选浓度为75 mg·L–1 , 在该体系下GUS瞬时表达率达到19.88%, 将侵染后的茎尖在生根筛选培养基中进行生根诱 导, 筛选出26株抗性植株, 通过炼苗移栽最终获得 15株转基因大麻完整植株。
农杆菌和受体材料的相互作用是转化成功与 否的关键, 该相互作用的过程受诸多因素的影响,
这些影响因素大致可分为内部因素和外部因素两 大类。内部因素是指材料自身的影响, 即基因型。 基因型对转化效率起着决定性作用, 相同植物不 同基因型的转化效率也存在较大差异。Sorokin等 (2020)选取了Candida CD-1、Nightingale、Green Crack CBD和Holy Grail×CD1的杂交种等4种大麻 进行农杆菌介导的遗传转化实验, 发现Nightingale 的转化效率最高。外部因素包括: 外植体大小、培 养基成分、植物生长激素、农杆菌菌株、载体和 培养条件等。外植体选取过大时则会导致非胚性 细胞增多, 影响胚性细胞进行分化; 选取过小则承 受不住农杆菌的伤害而死亡, 不利于后期转化(赵 越等2015)。菌液浓度和感染时间是一个综合效应, 低浓度短时间和高浓度长时间浸染转化率同样低 (魏开发等2009)。而在后期进行转基因植株的筛 选过程中, 抗生素的加入是必不可少的, 需选择合 适的抗生素浓度抑制农杆菌的生长, 以保证茎尖 的存活与生长(张园等2020), 但是在某些情况下抗 生素的加入可能会对工业大麻再生芽的产生造成 不利影响(Galán-Ávila等2021)。除此之外, 增加一 些物理手段也能促进农杆菌成功侵染外植体的概 率, 如Deguchi等(2020)在传统的农杆菌介导的遗 传转化的基础上, 配合真空渗透和超声处理的物 理手段, 最终在大麻叶片、雄花、雌花、茎和根中 均观察到了GUS瞬时表达。
本研究中发现, 过高的菌液浓度及过长时间 的共培养均会导致后期进行工业大麻抗性茎尖培 养过程中的农杆菌过度生长, 从而不利于再生芽的 产生, 故而本实验过程中将菌液浓度调整为OD600 为0.5、共培养时间为48 h时较为合适; 在进行侵 染的过程中, 同时进行真空渗透处理, 可有效促进 农杆菌对外植体材料的侵染, 从而提高转化效率。 在生根筛选培养过程中, 以WPM培养基为基本培 养基, 并适量的添加一定浓度的天冬酰胺和谷氨 酰胺, 可促进茎尖生根, 从而大大提高获得完整的 转基因植株的概率。然而, 由于不定根分化于未转 化的受体下胚轴, 筛选培养基中卡那霉素的添加 会在一定程度上抑制根系生长, 故而筛选出抗性 再生芽后, 需将其继代至无卡那霉素的生根筛选 培养基中进行生根诱导。此外, 再生植株在移栽前 进行壮苗培养, 可有效提高再生植株的移栽成活 率, 这与前人研究结论一致(余孟娟等2022)。本实 验对最终产生的转基因植株进行了GUS染色, 并 经PCR检测初步确定其确为阳性植株, 后续可进一 步利用Southern杂交方式确定转基因植株目的基 因的拷贝数, 且茎尖转化易存在嵌合体等情况, 尚 需对转基因材料是否存在嵌合体现象进行鉴定, 并对转基因植株通过自交获得高世代材料, 分析 目的基因在转基因植株中是否可以稳定遗传。综 上所述, 该遗传转化体系的建立为工业大麻分子 育种奠定了一定基础, 也为其他作物遗传转化体 系的建立提供了借鉴。
