非转基因抗除草剂油菜细胞质雄性探讨

　　目前，油菜是中国重要的油料作物，其种植面积已经达到了667万hm2，占到了世界油菜种植面积的1/3[1-3];随着农业结构的调整和乡村振兴的发展，近年来种植面积还有所增加。在中国，油菜生产主要集中在长江流域和西南地区，约占中国油菜生产面积的90%~93%[4-5]，但这些地区多以稻-油或稻-稻-油的轮作方式进行种植，田间杂草危害成为制约油菜集约化和机械化发展的主要生物逆境因素。当前去除油菜田间杂草的主要方式以人工除草为主，随着城镇化发展，农村剩余劳动力不足，而人工除草耗时长，用工量大，显著增加了油菜种植成本，导致油菜种植效益低下，降低农户种植积极性，制约油菜生产发展[6];尽管当前已有油菜田间封闭除草剂的推广应用，但是喷施时间范围有限、受到田间土壤持水量、空气水分饱和度等因素的影响，往往使用效果不理想，若降雨天气较多，容易导致油菜田间发生药害，因此选育抗除草剂油菜品种是从根本解决化学除草、提高油菜规模化、机械化种植的重要途径。1985年，Comai将鼠伤寒沙门氏菌的aroA突变基因转移到烟草上，首次获得抗草甘膦的转基因植物，之后多个研究者从拟南芥、胡萝卜、矮牵牛、烟草等植物和农杆菌、大肠杆菌等细菌中分离克隆了多种EPSPS基因[7-11]。1999年，中国从加拿大引入了抗草甘膦的油菜种质资源Q3，该资源具有抗草甘膦CP4基因和草甘膦氧化酶基因gox双价基因，伴随着生物技术和基因工程的发展，到目前为止已选育出了一大批具有抗除草剂特性的油菜种质资源和品系[12-16]，但这些资源和品系都是转基因油菜，目前中国的转基因抗除草剂油菜还没有批准进入商业化栽培，转基因油菜品种较难应用到生产实践中。因此，非转基因抗除草剂油菜种质资源的创制是解决中国选育非转基因抗除草剂油菜品种的关键。诱变育种可以通过物理化学的方法诱发有机体产生遗传性的变异，通过人工选择、鉴定培育新品种的途径，在不添加外源基因的情况下有效改变已有基因，有效提高品种选育效率，解决转基因存在的不足[17-19]，鉴于此，利用诱变育种的方式选育非转基因抗除草剂油菜品种有利于当前油菜生产发展的需要。本研究探索了利用诱变育种技术获得非转基因抗除草剂油菜细胞质保持系资源，进而转育成非转基因抗除草剂油菜细胞质雄性不育系，选育出抗除草剂油菜品种，现把育种方法和品种选育过程进行阐述，以期为选育新的非转基因抗除草剂油菜提供理论借鉴。

　　1材料与方法

　　1.1试验材料

　　供试的育种品系均来源于陕西省杂交油菜研究中心种质资源库，均不抗除草剂，具体为：诱变材料‘陕9B’，该品系是细胞质雄性不育保持系;转育的母本‘陕9A’，是细胞质雄性不育系;非转基因抗除草剂油菜的父本编号分别为‘R1’、‘R2’、‘R3’、‘R4’、‘R5’、‘R6’、‘R7’，是细胞质雄性不育恢复系;大田品比试验的对照品种为‘秦优7号’。诱变剂为EMS，除草剂为山东侨昌现代农业有限公司生产的有效成分含量为10%的苯磺隆可湿性粉剂。

　　1.2试验方法

　　1.2.1诱变处理利用0.5%的EMS溶液浸泡‘陕9B’种子16h，浸泡处理完后，用自来水将其冲洗2h，在人工气候室内，将处理好的种子种植于发芽盘中，同时在苗盘中播种未处理的种子做对照，等种子萌发长至两子叶完全伸展后即用山东侨昌现代农业有限公司生产的有效成分含量为10%的苯磺隆可湿性粉剂，配制成浓度为600mg/L的溶液喷雾处理，同时对照也采取相同方法处理;10天后调查幼苗死亡情况，诱变油菜苗喷施除草剂溶液后将没有受到除草剂伤害的幼苗移栽到营养钵中放在人工气候室中继续生长;在抗性植株花期，对其套袋自交，成熟期收获种子;将收获的抗性种子在秋季播于试验田中，同时播种未处理的种子做对照，在油菜生长到三叶一心期时喷施除草剂溶液处理，10天后调查幼苗死亡情况，对除草剂伤害不明显的幼苗进行二次喷施除草剂以去除假抗性植株，对正常生长的诱变抗性植株在花期全部套袋自交，对每个抗性植株编号，成熟期收获种子后，对所收获的抗性种子做抗性基因检测和转基因鉴定。1.2.2抗性转育将所收到的抗性种子在花期与非抗除草剂甘蓝型油菜细胞质雄性不育系‘陕9A’进行杂交，采取多株系单株对测。在次年秋季对所得到杂交组合及相应父母本进行种植，在三叶一心期时喷施除草剂溶液处理。对未受除草剂影响的杂交组合在花期调查其雄性不育性，同时对相应父本套袋自交。选择对测组合全为雄性不育的组合与其相应父本继续进行回交，得到BC1代，按照同样步骤连续进行6代回交，得到具有非转基因抗除草剂特性的纯合细胞质雄性不育系。1.2.3杂交组合利用得到的非转基因抗除草剂不育系与恢复系杂交，配制杂交组合进行品比试验。

　　2结果与分析

　　2.1EMS诱变处理的浓度

　　不同浓度的EMS诱变液处理下‘陕9B’种子的发芽情况不同(如图1)。浓度为0.00%的EMS(对照)诱变液处理下‘陕9B’的发芽率达到了100%，而用浓度分别为0.25%、0.5%、0.75%的EMS诱变液处理后的种子，随着处理浓度的增大，发芽率降低的幅度逐渐增大，当浓度为0.75%时，发芽率仅有27%。在不同EMS浓度处理中，0.5%的EMS处理条件下种子发芽率43.5%;根据诱变处理的半致死剂量原则，综合考虑选择浓度为0.5%的EMS诱变液对油菜‘陕9B’种子进行诱变处理。

　　2.2非转基因抗除草剂保持系的创制

　　利用0.5%的EMS溶液诱变处理‘陕9B’的种子，通过苗期大量的除草剂抗性试验筛选，对具有抗性的植株进行移栽培育、收获种子，再次通过田间抗除草剂特性鉴定和转基因检测，鉴定结果为非转基因油菜、具有抗除草剂特性(如图2)。将创制出的抗除草剂种质资源，命名为‘陕9BK’。

　　2.3非转基因抗除草剂不育系的选育

　　利用创制的非转基因抗除草剂油菜‘陕9BK’为父本，与母本‘陕9A’杂交，得到F1代不育系，利用‘陕9BK’做回交亲本，继续与F1代回交转育，经过多代回交育成非转基因抗除草剂油菜细胞质雄性不育系‘陕9AK’，选育过程如图3。

　　2.4非转基因抗除草剂杂交组合

　　利用非转基因抗除草剂油菜雄性不育系‘陕9AK’与恢复系‘R1’、‘R2’、‘R3’、‘R4’、‘R5’、‘R6’、‘R7’分别配制杂交组合，在各杂交组合中‘陕9AK×R3’的产量最高，居参试组合第1位，较对照增产6.95%，其次为‘陕9AK×R6’、‘陕9AK×R1’、‘陕9AK×R4’和‘陕9AK×R2’，‘陕9AK×R5’和‘陕9AK×R7’较对照减产。试验结果表明，‘陕9AK×R3’、‘陕9AK×R6’、‘陕9AK×R1’三个组合的生长势强，整齐一致，产量高，增产潜力大，抗病抗倒，熟期适中，苗期对除草剂的抗性强，适宜田间化学锄草。

　　3讨论

　　3.1EMS诱变浓度在诱变育种中的重要性

　　在作物诱变育种试验中，诱变剂的处理浓度和所诱变作物种子群体的大小直接影响着诱变的效果和诱变目标性状是否出现的关键。合适的诱变处理浓度和处理时间能够有效保证群体诱变的可靠性，而且相对较大的诱变群体可保证诱变的饱和度，提高诱变目标性状出现的频率。本研究中，根据半致死剂量原则和浓度试验，探索出对‘陕9B’的最佳诱变浓度为0.5%的EMS溶液，又因油菜种子小，相同质量下油菜籽粒数量多，诱变群体相对较大;通过分批次处理以及苗期喷施除草剂筛选抗除草剂油菜出现突变体的概率高。

　　3.2非转基因抗除草剂油菜的利用价值

　　利用已选育的非转基因抗除草剂细胞质雄性不育系‘陕9AK’与已有的优良恢复系配制组合可有效提高选育适宜机械化栽培管理的油菜品种，如配制的组合‘陕9AK×R3’不但具有抗除草剂特性，而且相对增产幅度较大。江苏农科院是在国内开展抗除草剂较早的研究单位，浦惠明等在抗磺酰脲类除草剂油菜新品种选育中也取得了较大进展[20-26]，利用选育的具有抗性的种质资源‘M342’作为轮回亲本，与农艺性状优良的品系进行杂交、回交，转育抗性性状，目前已经选育出一批性状优良具有抗性的亲本系和组合，并且育成中国第一个抗磺酰脲类除草剂的油菜新品种‘宁R101’，登记编号为GPD油菜(2018)320256，并且在组合试验中增产显著[6]。抗除草剂油菜的应用，有效提高了田间除草效率，减少了杂草对油菜生长的危害，提高土壤营养利用效率，保障了油菜正常生长，加快了机械化田间管理，提高了油菜种植效益。

　　3.3非转基因抗除草剂油菜细胞质雄性不育系的选育意义

　　目前，中国多个育种单位通过诱变育种的方式获得了抗除草剂油菜种质资源，而且正在培育抗除草剂油菜杂交种，但这些多数是对父本抗除草剂特性的改良，母本为非抗除草剂油菜，杂交种具有抗除草剂特性，尽管在田间化学锄草的同时可以消除母本自交结实产生的假杂种，但杂交种制种环节没有简化[27-29]。传统的油菜制种模式为防止父本混入杂交种中需要提前割除父本，投入劳动力较多、人工成本高，难以实现机械化。非转基因抗除草剂质不育的应用，可在制种中按照一定比例混合父母本种子，父本为不抗除草剂的恢复系，混合播种混合收获，无需割除父本;大田栽培种，在油菜苗期化学除草可灭除恢复系，从而保证田间种植品种纯度和整齐度。非转基因抗除草剂质不育的利用，使杂种制种程序得到简化，即可减少制种用工量，降低制种成本，集约化规模化制种，也可解决油菜大田生产机械化播种用种成本高和有效控制种植密度的难题、实现机械化化学除草田间管理，提高油菜种植效益和农民种植的积极性。

　　4结论

　　本研究以浓度为0.5%的EMS溶液对‘陕9B’进行诱变，获得具有抗除草剂特性的‘陕9BK’种质资源，利用其做轮回亲本，选育出具有抗除草剂特性的油菜细胞质雄性不育系‘陕9AK’，利用‘陕9AK’做母本配制杂交组合，获得具有生长势强，整齐一致，产量高，增产潜力大，抗病抗倒，熟期适中，苗期对除草剂的抗性强，适宜田间化学锄草的杂交组合‘陕9AK×R3’、‘陕9AK×R6’和‘陕9AK×R1’;同时‘陕9AK’的利用可简化油菜制种程序，降低制种成本，提高农户种植效益。

　　《非转基因抗除草剂油菜细胞质雄性探讨》来源：《中国农学通报》，作者：关周博 董育红 田建华 王学芳 张忠鑫 郑磊

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