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发布时间：2013-11-27 15:18所属分类：基础学论文浏览：1次加入收藏
附子具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛之功效，为回阳救逆之要药[1]。常用于大汗亡阳，吐泻厥逆，肢冷脉微，心腹冷痛，风寒湿痹，阳痿，宫冷，阳虚外感，阴疽疮疡以及一切沉寒痼冷之疾。现代研究表明，附子的主要化学成分除乌头类生物碱外，还有醇胺、脂类及
附子具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛之功效，为回阳救逆之要药[1]。常用于大汗亡阳，吐泻厥逆，肢冷脉微，心腹冷痛，风寒湿痹，阳痿，宫冷，阳虚外感，阴疽疮疡以及一切沉寒痼冷之疾。现代研究表明，附子的主要化学成分除乌头类生物碱外，还有醇胺、脂类及多糖等。乌头碱是附子的有效成分同时也是毒性成分。为保证用药的安全有效，本文以附子为对象，以新乌头碱、次乌头碱和乌头碱的含量为指标进行研究，比较不同采收期三种生物碱的含量差异。进而为附子质量评价和临床应用提供借鉴。
【摘要】目的考察不同采收时间的附子中新乌头碱、次乌头碱和乌头碱的含量。方法采用高效液相色谱法进行测定，色谱柱为DiamonsilC18柱(150mm×4.6mm,5μm);流动相A：乙腈-四氢呋喃(25：15);流动相B:0.1mol/L醋酸铵溶液，检测波长：λ=235nm;流速：1ml/min;柱温：25℃。结果不同采收时期附子中三种乌头碱的含量发生了明显变化，随着时间(7～9月份)的推移，新乌头碱的含量呈下降趋势，次乌头碱、乌头碱的含量呈上升趋势。结论此方法简单、易行，可为附子的进一步研究提供科学依据。
【关键词】附子,新乌头碱,次乌头碱,乌头碱,高效液相色谱法
1仪器与试药
1.1仪器
Aglient1100高效液相色谱仪(自动进样器，四元泵，DAD检测器)，HP1100/WIND3D化学工作站;超声波清洗机(北京创新德超声电子研究所);AE240电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)。
1.2试药
新乌头碱(批号:110799-200404，供含量测定用)，次乌头碱(批号:110798-200404，供含量测定用)，乌头碱(批号:0720-9807，供含量测定用)，均购于中国药品生物制品检定所;甲醇为色谱纯;水为乐百氏纯净水;其他试剂均为分析纯。
1.3药材
附子药材均采自贵州龙里，经贵阳中医学院药学系贺祝英教授鉴定为毛茛科植物乌头AconitumcarmichahliDebx.的子根。
2方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱为DiamonsilC18柱(150mm×4.6mm,5μm);流动相A:乙腈-四氢呋喃(25：15);流动相B:0.1mol/l醋酸铵溶液;洗脱程序见表1;检测波长：λ=235nm;流速：1ml/min;柱温：25℃;进样量10μl。表1洗脱程序
2.2溶液的制备
2.2.1对照品溶液的制备
取新乌头碱、次乌头碱和乌头碱对照品适量，置25ml容量瓶中,加异丙醇-二氯甲烷(1:1)混合溶液制成浓度为(新乌头碱0.2820mg/ml,次乌头碱0.2817mg/ml，乌头碱0.0802mg/ml)的混合对照品溶液。
2.2.2供试品溶液的制备
取本品粉末(过三号筛)约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加氨试液3ml,精密加入异丙醇-乙酸乙酯(1:1)混合溶液50ml，称定重量，超声处理30min,放冷，再称定重量，用异丙醇-乙酸乙酯(1:1)混合溶液补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。
2.2.3阴性样品溶液的制备
按上述供试品溶液的制备方法，制备不含附子的阴性样品溶液。
2.3系统适用性试验
分别取混合对照品溶液、供试品溶液及其阴性溶液各10μl，按“2.1”项下色谱条件进样。结果：阴性样品在新乌头碱、次乌头碱、乌头碱峰位置对应处无干扰峰出现。样品中三种乌头碱与其他成分完全分离，且分离度大于1.5。见图1。A阴性对照品;B混合对照品;C样品;1新乌头碱;2次乌头碱;3乌头碱图1三种溶液高效液色谱图
2.4线性关系考察
精密吸取混合对照品2、4、8、10、16、18μl，按“2.1”项下色谱条件进样。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算得新乌头碱回归方程为：Y=1225.9X+39.463,R2=0.9989;在0.56～5.08μg范围内呈良好线性关系。次乌头碱回归方程为Y=1301.5X+18.581，R2=0.9996;在0.56～5.07μg范围内呈良好线性关系。乌头碱回归方程为1011.4X+46.369,R2=0.9989;在0.08～1.44μg范围内呈良好线性关系。
2.5精密度试验
取“2.2”项下的对照品溶液10μl，按“2.1”项下色谱条件进样，重复测定6次。新乌头碱峰面积的RSD=0.51%;次乌头碱峰面积的RSD=0.76%;乌头碱峰面积的RSD=1.71%。结果表明，仪器精密度良好。
2.6稳定性试验
取“2.3”项下的供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别在0、2、4、6、8、10、12h进样，记录其峰面积。新乌头碱峰面积的RSD=1.55%，次乌头碱峰面积的RSD=1.08%，乌头碱峰面积的RSD=2.95%，结果表明供试品溶液在12h内稳定。
2.7重复性试验
按“2.3”项下的方法，平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，记录峰面积，计算含量。新乌头碱含量的RSD=2.05%，次乌头碱含量的RSD=1.34%，乌头碱含量的RSD=2.98%。结果表明此方法重复性良好。
2.8加样回收试验
称取同一附子样品1.00g(精密称定)，共9份。分别按高中低三个量加入新乌头碱、次乌头碱和乌头碱的对照品，按“2.3”项下的方法，制备供试品溶液。按“2.1”项下色谱条件测定，计算回收率，结果新乌头碱、次乌头碱、乌头碱的平均回收率分别为98.61%、97.52%、97.41%;RSD分别为1.71%，1.64%、1.89%。
2.9样品含量测定
精密称取不同采收时间的附子样品，按供试品溶液制备方法分别制备，按“2.1”项下色谱条件测定，计算含量。结果见表2。表2附子样品含量测定
3结果
分析测定结果表明，同一采收时间的附子中次乌头碱的含量最高，新乌头碱次之，乌头碱最低;不同采收时间的附子，随着时间(7～9月份)的推移，新乌头碱的含量呈下降趋势，次乌头碱、乌头碱的含量呈上升趋势;三种生物碱的含量之和随采收时间呈上升趋势。然而不能单凭含量来确定附子的最佳采收期，因为附子的有效成分恰是其毒性成分，用得妙可救人于危难，反之可害人于顷刻之间。为了科学合理地采收和利用附子资源，确保临床用药的安全有效，还应与附子的毒性及临床疗效结合起来，综合分析，方能全面系统地评价“最有用亦最难用”的中药附子，本实验可为附子的进一步研究提供科学依据。
【参考文献】
1黄兆胜.中药学.北京：人民卫生出版社，2002：225.
2张智琳.浅析四逆汤类方治疗心力衰竭的特点.中华中医药杂志，2005，2(4)：225-227.
3国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部.北京：化学工业出版社，2010：178.
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