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发布时间：2013-12-13 09:36所属分类：临床医学论文浏览：1次加入收藏
医学核心期刊 推荐《世界华人消化杂志杂志》创刊于 1989年，本刊为旬刊，主编：马连生。国内统一刊号：CN14-1260/R，国际刊 号：ISSN1009-3079。《世界华人消化杂志杂志》主要报道和刊登国内外、特别是我国消化病学者具有创造性的、有较高学术水平的基础和临
医学核心期刊推荐《世界华人消化杂志杂志》创刊于 1989年，本刊为旬刊，主编：马连生。国内统一刊号：CN14-1260/R，国际刊 号：ISSN1009-3079。《世界华人消化杂志杂志》主要报道和刊登国内外、特别是我国消化病学者具有创造性的、有较高学术水平的基础和临床研究论 文、研究快报等。
【摘要】目的:探讨肺间质成纤维细胞MMP2和MMP9在SiO2致肺纤维化中的表达及意义.方法:清洁级Wistar大鼠50只，随机分为对照组和实验组，实验组气管内注射SiO2悬液，对照组代以等剂量生理盐水.注射后1，3，7，14和28d分离和提取肺间质成纤维细胞，应用免疫细胞化学和逆转录多聚酶链式反应（RTPCR）方法，观察其MMP2，MMP9蛋白及其mRNA的动态变化.结果:①SiO2作用后1d成纤维细胞MMP2表达增高，7d达高峰，为对照组的3.887倍（t=23.667，P<0.001）；MMP9在SiO2作用后1d表达增高，7d达对照组的3.103倍（t=11.399，P<0.001）；②MMP2mRNA和MMP9mRNA的转录从SiO2作用后1d就开始升高.结论:受SiO2刺激后，肺间质成纤维细胞上调MMP2和MMP9的表达，损伤肺泡基底膜，启动肺纤维化的发生.
【关键词】基质金属蛋白酶,肺间质成纤维细胞,肺间质纤维化,矽肺
0引言
基质金属蛋白酶及其组织抑制物（matrixmetalloproteinaseandtissueinhibitorofmatrixmetalloproteinase,MMP/TIMP）是肺纤维化效应细胞分泌的生物活性分子，在细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)的合成和降解中具有重要意义.在MMP家族中，MMP2和MMP9的特异性底物主要是Ⅳ型胶原，而后者是肺泡壁基底膜的重要成分.肺泡上皮细胞和基底膜的损伤是肺间质纤维化过程的关键事件［1］.我们在SiO2所致肺纤维化形成过程中的不同阶段分离肺成纤维细胞（lungfibroblast,LFb），应用免疫细胞化学和逆转录多聚酶链式反应（RTPCR）对MMP2和MMP9蛋白及其mRNA进行探讨如下.
1材料和方法
1．1材料
健康雄性SD大鼠，体质量（180±40）g，由华北煤炭医学院医学实验动物中心提供.SiO2粉尘（中国预防医学科学院劳卫所）；小鼠抗波形蛋白（vimentin）mAb及免疫组化染色SABC试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；羊抗MMP2和羊抗MMP9多克隆抗体（SantaCruz产品）；免疫组化SP试剂盒（北京中山生物技术有限公司）；Trizol试剂盒（Gibco公司产品）；逆转录反应试剂盒（Takara公司产品）；PCR扩增试剂盒和DNA梯度Marker（Sangon公司）；引物由Sangon公司合成，PAGE纯化.MMP2引物序列为5′CTATTCTGTCAGCACTTTGG3′（sense），5′CAGACTTTGGTTCTCCAACTT3′（antisense），扩增片段长度为303bp.MMP9引物序列为5′AAATGTGGGTGTACACAGGC3′（sense），5′TTCACCCGGTTGTGGAAACT3′（antisense），扩增片段长度为303bp.内参照采用GAPDH，引物序列为5′CTTCTGAGTGGCAGTGATGG3′（sense），5′TGGCACAGTCAAGGCTGAGA3′（antisense），扩增片段长度为389bp.
1．2方法
大鼠50只，随机等分为实验组和对照组.实验组大鼠乙醚麻醉后，采用经气管染SiO2粉尘法复制矽肺模型［2］.SiO2粉尘悬液50g/L，生理盐水配制，每只大鼠1mL.对照组在相同条件下气管内注入生理盐水1mL.染尘后1，3，7，14，28d分别处死实验组和对照组各5只，无菌操作取肺.采用酶消化法结合组织块贴壁培养法分离和培养细胞.用SABC法检测细胞的波形蛋白（vimentin）的表达，以鉴定分离培养的细胞为肺间质成纤维细胞.
1．2．1免疫细胞化学检测MMP2和MMP9将第4代LFb接种于载玻片上，贴壁后，血清饥饿使其同步化，按照SP试剂盒说明，作细胞爬片的免疫细胞化学染色.羊抗鼠MMP2一抗和羊抗鼠MMP9一抗1∶150稀释.DAB显色.PBS代替一抗作阴性对照.染色结果经MoticMed6.0数码医学图像分析系统（北航）作图像分析，胞质中的棕褐色颗粒为表达阳性，表达强度用积分吸光度（A）表示.
1．2．2RTPCR检测MMP2和MMP9mRNA按照Trizol试剂盒说明提取细胞总RNA.逆转录步骤参照说明书进行，反应条件42℃15min，95℃2min；PCR扩增反应步骤参照说明书，反应条件94℃，45s；58℃，45s；72℃，80s；30个循环.扩增产物进行15g/L琼脂糖凝胶电泳.电泳条带采用凝胶成像系统做积分吸光度（A值）测定，以实验组和对照组MMP2,MMP9与GAPDH的A比值的表示MMP2mRNA的相对表达量.
统计学处理：数据以x±s表示，用SPSS11.0统计软件包进行组间t检验，方差不齐时用t′检验.
2结果
2．1MMP2和MMP9的表达矽肺模型组大鼠LFbMMP2和MMP9表达比对照组明显增强，7d为表达高峰(Tab1,Fig1).表1肺间质成纤维细胞MMP2,MMP9蛋白及mRNA表达的动态变化（略）
2．2MMP2和MMP9mRNA的变化模型组LFbMMP2和MMP9mRNA表达与对照组比较明显增高(Tab1).
3讨论
长期吸入SiO2粉尘引起的矽肺，其主要病理改变是矽结节形成和间质纤维化,但其发病机制尚未完全阐明.目前认为,吸入SiO2粉尘后，肺泡巨噬细胞、中性粒细胞等分泌多种细胞因子，导致肺泡炎的发生发展，最终引起进行性肺间质纤维化.纤维化的发生是细胞外基质合成与降解不平衡的结果.近年来，细胞外基质降解系统尤其是基质金属蛋白酶及其组织抑制因子功能紊乱，在纤维化疾病中愈来愈受到重视.研究表明，基质金属蛋白酶在细胞外基质的降解与重塑的病理生理发展过程中起关键性作用.MMP2和MMP9的特异性底物是Ⅳ型胶原，而后者是肺泡壁基底膜的重要成分.由致病因素引起的MMP2,MMP9高表达在破坏肺泡上皮细胞基底膜继而纤维母细胞侵入肺泡腔引起肺纤维化中起作用［3］.动物实验和临床调查均表明，在肺纤维化中有MMP2和MMP9的高表达［4］.
本结果显示,注入SiO2粉尘后1dMMP2蛋白表达即显著升高，达到对照组的1.245倍（t=2.660，P<0.05），7d达到高峰，为对照组的3.887倍（t=23.667，P<0.01），28d仍显著高于对照组（t=5.621，P<0.01）.其mRNA表达亦明显增高.MMP9及其mRNA表达和对照组比较在1，3，7d显著升高.提示在肺间质纤维化早中期，肺间质成纤维细胞是MMP2和MMP9来源之一.肺间质成纤维细胞可能通过高表达MMP2和MMP9，启动了介于炎症细胞之间、炎症细胞与肺组织结构细胞之间以及细胞与细胞外基质之间持续进行性发展的“crosstalking”［5］.研究表明，在肺纤维化模型中肺间质成纤维细胞可以高表达MMP2，亦有学者对肺纤维化患者的肺成纤维细胞进行体外培养，亦发现其具有显著增高的MMP9表达［6］.可见，肺间质成纤维细胞不单纯是肺纤维化的效应细胞.注入SiO2粉尘后，肺间质成纤维细胞通过表达MMP2和MMP9，参与肺泡基底膜的损伤，从而参与启动肺纤维化.
【参考文献】
［1］LaskyJA,OrtizLA.Antifibrotictherapyforthetreatmentofpulmonaryfibrosis［J］.AmJMedSci,2001;322(4):213-221.
［2］邹昌淇,杜庆成,周培宏.联合用药治疗大鼠早期矽肺的疗效观察［J］.中华劳动卫生职业病杂志,2001;19(1):7-9.
ZouCQ,DuQC,ZhouPH.Studyontherapeuticeffectofcombineduseofantisilicosisdrugsonearlyexperimentalofrats［J］.ChinJIndHygOccupDis,2001;19(1):7-9.
［3］SelmanM,RuizV,Cabrera,etal.TIMP1,2,3and4inidiopathicpulmonaryfibrosis.Aprevailingnondegradativelungmicroenvironment［J］.AmJPhysiolLungCellMolPhysiol,2000;279(3):L562-L574.
［4］SugaM,IycnagaK,OkamotoT,etal.Elevationofmatrixmetalloproteinaseactivityinidiopathicinterstitialpneumonias［J］.AmJRespirCritCareMed,2000;162(5):1949-1956.
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