发表SCI论文当归多糖调控人白血病干细胞衰老的机制研究

发布时间：2015-02-03 14:35所属分类：临床医学论文浏览：1次加入收藏

[摘要]目的：探讨当归多糖(Angelica sinensis polysaccharide，ASP)体外诱导人白血病干细胞衰老的相关机制。方法：免疫磁性分选法分离人急性髓系白血病患者骨髓白血病干细胞(leukemia stem cells，LSCs);不同质量浓度的当归多糖(20～80 mgL-1)体外诱导LSCs 4

　　[摘要]目的：探讨当归多糖(Angelica sinensis polysaccharide，ASP)体外诱导人白血病干细胞衰老的相关机制。方法：免疫磁性分选法分离人急性髓系白血病患者骨髓白血病干细胞(leukemia stem cells，LSCs);不同质量浓度的当归多糖(20～80 mg・L-1)体外诱导LSCs 48 h，CCK-8检测LSCs增殖能力;甲基纤维素半固体培养法检测LSCs形成白血病细胞集落(CFU-LC)能力;透射电子显微镜分析细胞超微结构变化;β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测细胞衰老;qRT-PCR分析LSCs衰老相关基因p53，p21，p16和Rb表达;Western blotting 检测P16，Rb，CDK4和Cyclin E蛋白表达。结果：分选后LSCs纯度达(91.15±2.41)%，形态良好。经不同浓度当归多糖作用后，LSCs呈现明显的的浓度依赖性增殖抑制。40 mg・L-1当归多糖作用LSCs 48 h，其SA-β-Gal染色阳性细胞率明显升高，CFU-LC形成能力下降;超微结构显示细胞线粒体肿胀，溶酶体数量增多，异染色质边集;衰老相关基因p53，p21，p16和Rb表达上调;衰老相关蛋白P16和Rb表达上调， CDK4和Cyclin E表达下调。结论：当归多糖在体外能诱导人LSCs衰老，推测其可能机制与当归多糖调控P16-Rb信号通路有关。

　　[关键词]发表SCI论文,当归多糖,白血病干细胞,衰老,调控机制

　　Biological mechanisms of human-derived leukemia stem cells senescence

　　regulated by Angelica sinensis polysaccharide

　　JIA Dao-yong， LIU Jun， LI Cheng-peng， LI Jing， ZHANG Meng-si， ZHANG Yan-yan， JING Peng-wei，

　　XU Chun-yan， WANG Ya-ping*

　　(Institute of Stem Cell and Tissue Engineering， Department of Histology and Embryology，

　　Chongqing Medical University， Chongqing 400016， China)

　　[Abatract]Objective： To explore the biological mechanisms underlying Angelica sindsis polysaccharide (ASP)-induced aging of human-derived leukemia stem cells(LSCs) in vitro. Method： Acute myelogenous leukemia stem cells were isolated by magnetic activated cell sorting(MACS).The ability of LSC proliferation treated by various concentration of ASP(20-80 mg・L-1)in vitro for 48 hours were tested using cell counting Kit-8(CCK8) ， colony forming were evaluated by methylcellulose CFU assay. The ultra structure changes of AML CD34+CD38- cells were analyzed by transmission electron microscopy. The aging cells were detected with senescence-β-galactosidase Kit staining. Expression of aging-related p53，p21，p16， Rb mRNA and P16， Rb， CDK4 and Cyclin E protein were detected by quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(qRT-PCR) and Western blotting， respectively. Result： The purity of the CD34+CD38- cells is (91.15±2.41)% after sorted and showed good morphology. The proliferation of LSC was exhibited significantly concentration-dependent inhibited after exposure to various concentration of ASP. Treated by 40 mg・L-1 ASP for 48 hours， the percentage of positive cells stained by SA-β-Gal was dramatically increased (P<0.01) and the colony-formed ability has been weakened(P<0.01). The observation of ultrastructure showed that cell heterochromatin condensation and fragmentation，mitochondrial swelling，lysosomes increased in number. Aging-related p53，p21，p16， Rb and P16， Rb were up-regulated， protein regulatory cell-cycle CDK4 and Cyclin E were down-regulated. ASP may induce the senescence of LSCs effectively in vitro， P16-Rb cell signaling pathway play a significant role in this process. Conclusion： ASP can induce human leukemia stem cell senescence in vitro， the mechanism involved may be related to ASP regulation P16-Rb signaling pathways. 　　[Key words]Angelica sinensis polysaccharide(ASP); leukemia stem cell; senescence; regulatory mechanisms

　　doi：10.4268/cjcmm20150122

　　白血病干细胞(leukemia stem cells，LSCs)在白血病的发生与发展，耐药与复发中起着关键性作用，因此有效杀灭LSCs是根治白血病的重要途径[1]。当归是中医临床“补血活血”要药，当归多糖(Angelica sinensis polysaccharide，ASP)是其重要药效成分，具有提高免疫功能、促进血细胞发生、抗辐射、抗肿瘤等药理作用[2-5]。作者的研究表明，当归多糖有明显延缓造血干/祖细胞衰老和促进人白血病细胞衰老的“双向调控”作用[6-8]，当归多糖能否诱导LSCs衰老?目前尚未见文献报道。本文探讨当归多糖对人急性髓性LSCs诱导衰老的作用及其机制，旨在为寻找诱导肿瘤干细胞衰老，且低毒高效的天然药物诱导剂提供理论和实验室依据，为白血病治疗提供新思路和新途径。

　　1材料

　　1.1药品和试剂当归多糖(ASP)购自西安次元生物试剂有限公司，纯度95%;用PBS配成8 g・L-1的母液，-20 ℃保存。RPMI1640培养基购自美国GIBCO公司;干细胞无血清培养基购自美国STEM CELL公司;CCK-8、衰老相关-β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色试剂盒购自碧云天公司;Anti-P16，Anti-CDK4，Anti-Cyclin E一抗，羊抗兔二抗购自Bioss公司。

　　1.2标本急性髓系白血病患者为初诊病人，未经任何治疗(基于FAB分型，其中2例M0，3例M1，3例M3，2例M4，2例M5，3例M6)，骨髓由重庆医科大学第一附属医院血液科采集。

　　2方法

　　2.1免疫磁性分选法分离纯化CD34+CD38--LSCs骨髓标本抗凝处理后加入等体积Ficoll-Paque淋巴细胞分离液，离心分离患者骨髓获取白血病单个核细胞(LMNCs)，将1×107～4×107个LMNCs加入90 μL Buffer和10 μL Anti-CD34-FITC中，4 ℃孵育10 min，离心弃上清，加入80 μL Buffer和20 μL Anti-FITC MicroBeads，4 ℃孵育20 min，离心弃上清，用0.5 mL Buffer重悬细胞，加入磁场分离柱内，流出道收集未标记的CD34-细胞，0.5 mL Buffer洗柱3次，取下分选柱，加入0.5 mL Buffer冲出标记的CD34+细胞。将获取的CD34+细胞重复上述过程分选出CD34+CD38-的白血病干细胞(LSCs)。收集分选的LMNCs及分选后CD34+CD38-细胞，流式细胞术检测分选细胞纯度，台盼蓝染色检测细胞的存活率。

　　2.2CCK-8实验检测CD34+CD38--LSCs增殖能力收集分选的CD34+CD38--LSCs，按每孔5×103细胞/100 μL接种于96孔板中，常规培养24 h。当归多糖组：每孔加入终浓度为20，40，80 mg・L-1的当归多糖(体积为10 μL);对照组：常规培养，不加当归多糖。每组设置5个复孔，继续培养48 h，各孔加入10 μL CCK-8培养4 h，酶标仪检测吸光度，评价细胞增殖能力。

　　2.3SA-β-Gal酶染色检测CD34+CD38--LSCs衰老40 mg・L-1的当归多糖共培养CD34+CD38--LSCs 48 h，分别收集各组细胞3×106个，PBS洗涤1次，β-半乳糖苷酶染色固定液室温固定15 min，PBS洗涤3次，加入SA-β-Gal染液，在无CO2 ，37 ℃条件下孵育染色过夜，涂片后显微镜下观察染色阳性细胞数，计算阳性细胞百分率。

　　2.4透射电子显微镜观察CD34+CD38--LSCs衰老形态学收集经40 mg・L-1的当归多糖处理组与对照组的CD34+CD38--LSCs各1×105个，PBS洗涤1次，2.5%戊二醛前固定2 h，1%四氧化锇后固定2 h，乙醇梯度脱水，树脂包埋，制备超薄切片，醋酸双氧铀和硝酸铅电子染色，H-600型透射电镜观察并照相。

　　2.5甲基纤维素半固体培养检测CD34+CD38--LSCs形成集落的能力当归多糖组：加入终浓度为40 mg・L-1的当归多糖作用1×104个LSCs;对照组：加入同等数量细胞，但不加当归多糖。2组分别加入甲基纤维素半固体培养液1 mL，充分混匀后接种于24孔板中，各组设置3个复孔，在 37 ℃，5%CO2培养箱中孵育10～14 d，倒置相差显微镜下观察计取每组集落数，以评价LSCs形成集落的能力。

　　2.6Quantitative RT-PCR 检测衰老基因表达提取当归多糖组和对照组的CD34+CD38--LSCs总RNA，逆转录法检测衰老相关基因表达，参照试剂盒说明书操作进行，采用SYBYGreen染料法进行实时定量PCR反应，用2-ΔΔCt方法确定衰老相关基因的mRNA表达水平，Ct为每个反应管内荧光信号到达设定阈值时的循环数，反应条件为95 ℃预变性30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共39个循环;最后进行熔解曲线的检测。

　　GAPDH：上游5′-ATGTTCGTCATGGGTGTGAA-3′，下游5′-TGAGTCCTTCCACGATACCA-3′;p53：上游 5′-CTCCTCAGCATCTTATCCGAGT-3′，下游5′-GCTGTTCCGTCCCAGTAGATTA-3′;p16：上游5′-CCCAACGCACCGAATAGTTAC-3′，下游5′-CACGGGTCGGGTGAGAGT-3′;p21：上游5′-CCTCTTCGGCCCGGTGGAC-3′，下游5′-CCGTTTTCGACCCTGAGAG-3′;Rb：上游5′-TTATCAAAGCAGAAGGCAACTT-3′，下游5′-TAAGAGGACAAGCAGATTCAAGG-3′。 　　2.7Western blotting 检测衰老相关蛋白表达分别收集对照组和40 mg・L-1的当归多糖处理48 h后的CD34+CD38--LSCs，PBS洗涤1次，转入EP管中，加入细胞裂解液重悬细胞，冰上裂解45 min后低温下14 000×g离心5 min，收集上清，BCA试剂盒测定各组蛋白浓度。各组取等量蛋白经SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉摇床封闭2 h，加1∶2 000稀释的Anti-P16和1∶800稀释的Anti-Rb，4 ℃孵育过夜;TBST缓冲液漂洗1 h后加1∶5 000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，室温孵育1.5 h;TBST漂洗1 h;ECL增强发光试剂显色后凝胶呈像仪照相。

　　2.8统计学分析用SPSS 16.0软件对数据进行统计学分析，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，P<0.05为有统计学意义。

　　3结果

　　3.1CD34+ CD38--LSCs的分选与纯化采用免疫磁性分选法成功从急性髓系白血病患者的骨髓单个核细胞中获得CD34+CD38--LSCs。倒置显微镜观察见细胞形态饱满，透明度高，折光性强。流式细胞术检测分选前LSCs纯度为(1.02±0.08)%， 分选后为(91.15±2.41)%(图1)。

　　3.2当归多糖体外作用对CD34+CD38--LSCs增殖的影响CD34+ CD38--LSCs经不同质量浓度当与空白对照组相比1)P<0.05(表1，2，图6，7同)。

　　3.3当归多糖对CD34+CD38--LSCs的SA-β-Gal染色阳性率影响CD34+CD38--LSCs经40 mg・L-1当归多糖作用48 h，SA-β-Gal染色阳性率为(90.4±3.0)%，对照组的SA-β-Gal染色阳性率为(2.6±0.9)%，提示当归多糖能有效诱导CD34+CD38--LSCs衰老(P<0.01，图3)。

　　3.4当归多糖体外作用对CD34+CD38--LSCs超微结构的影响CD34+CD38--LSCs经40 mg・L-1当归多糖作用48 h，可见细胞线粒体肿大;溶酶体数量增多，体积增大;核膜内陷、核内包含物形成;核异染色质聚集或碎裂等衰老表现(图4)。

　　3.5当归多糖体外作用对CD34+CD38--LSCs形成细胞集落影响CD34+CD38--LSCs经40 mg・

　　L-1当归多糖作用48 h，形成细胞集落数目为(48.45±16.66)，明显低于空白对照组(94.45±12.99)(P<0.01，图5)。

　　3.6当归多糖体外作用对CD34+CD38--LSCs衰老相关基因表达的影响CD34+CD38--LSCs经40 mg・L-1当归多糖作用48 h，衰老相关基因p53，p21，p16，Rb表达较对照组明显增高(图6)。

　　3.7当归多糖对 CD34+CD38--LSCs细胞周期相关蛋白表达影响CD34+CD38--LSCs经40 mg・L-1当归多糖作用48 h，衰老相关蛋白P16，Rb的表达水平增高，细胞周期调控蛋白CDK4，Cyclin E表达水平降低。将各蛋白与对应的内参灰度的比值进行分析，差异具有统计学意义(图7)。

　　4讨论

　　白血病干细胞(LSCs)在白血病的发生与发展，复发与耐药中起着极为重要的作用。因此，如何杀灭LSCs已经成为研究和治疗白血病的重大科学问题。目前，传统的化疗药物虽然对白血病治疗有缓解作用，但难以根治，且大剂量使用化疗药物会产生严重的毒副作用。因此，寻找既能杀灭白血病细胞，又能保护正常造血功能的天然诱导剂就成为治疗白血病研究的新策略[9]。

　　当归是祖国传统医学的“补血活血”要药， 当归多糖是当归的重要药效成分。研究证明，当归多糖具有调控免疫功能，促进血细胞发生，抗肿瘤和抗辐射损伤等多方面的药理作用[2-5]。课题组最新研究表明，当归多糖可通过调节细胞周期蛋白表达及抑制端粒DNA损伤等途径延缓正常造血干/祖细胞衰老，同时当归多糖还可诱导人白血病细胞的衰老，这进一步证明当归多糖具有“双向调控”或“扶正祛邪”作用[6-7，10-11]。当归多糖是否能够调控白血病干

　　细胞衰老目前尚未见报道。如果当归多糖既能延缓造血干细胞衰老，又能促进白血病干细胞衰老，这对有阐释“双向调控”或“扶正祛邪”的中医药理论有重要学术价值，而且对研发肿瘤治疗的天然药物诱导剂也有重要应用前景。

　　细胞衰老与死亡是生命活动中的自然现象，利用人为方法促进或诱导肿瘤细胞衰老是治疗肿瘤的新观点[12]。本研究在成功分离纯化人CD34+CD38--LSCs的基础上，用不同质量浓度的当归多糖(20～80 mg・L-1)体外作用CD34+CD38--LSCs。结果证明，当归多糖对CD34+CD38--LSCs的增殖有显著的抑制作用，并且呈现浓度依赖性抑制的特征性表现。CD34+CD38--LSCs经40 mg・L-1当归多糖作用48 h，其形成细胞集落的能力明显降低。研究证实，当归多糖不仅可能抑制CD34+CD38--LSCs增殖，还能降低其形成白血病细胞集落的能力。

　　衰老相关β半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色方法是证明细胞衰老公认的生物学标志和有力证据[13]。本实验证明，当归多糖作用CD34+CD38--LSCs后SA-β-Gal染色阳性率显著增加，提示细胞发生了衰老变化。超微结构观察发现衰老细胞的线粒体体积增大;溶酶体体积增大，数目增多，染色质碎裂、核膜内陷、核内包含物形成，异染色质聚集，这些变化符合衰老形态学特点[14]。因此，实验结果提示当归多糖对CD34+CD38--LSCs确有诱导衰老的作用。　　目前认为，p53-p21，p16-Rb通路是调控细胞衰老重要的2条信号转导通路[15-17]。研究表明，p21基因的失活可使细胞的衰老受到抑制，p53对细胞周期的诱导使其能够诱导p21的表达上调，而p21则可抑制CDKs的活性，从而抑制Rb和转录因子E2F的磷酸化过程诱导细胞的生长停滞。p16基因的表达对细胞衰老的维系具有重要的作用，它可选择性的抑制CDK4和CDK6，进而抑制pRB磷酸化使细胞增殖停滞。本研究发现当归多糖作用CD34+CD38--LSCs后，使p16，p53，p21，Rb mRNA和P16，Rb蛋白表达水平增高，细胞周期调控蛋白CDK4，Cyclin E表达水平降低，这提示当归多糖对白血病干细胞的抑制作用是通过诱导其衰老实现的。

　　综上所述，当归多糖能有效诱导CD34+CD38--LSCs的衰老，其机制可能与调控细胞衰老信号转导通路相关。结合课题组既往工作，认为当归多糖也可以在干细胞水平发挥“扶正驱邪”或“双向调控”作用。本研究结果为白血病的治疗提出了新的策略和途径。

　　[参考文献]

　　[1]Bonnet D， Dick J E.Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietie cell[J].Nat Med，1997，3(7)：730.

　　[2] Cao W， Li X Q， Wang X， et al.A novel polysaccharide， isolated from Angelica sinensis (Oliv.) Diels induces the apoptosis of cervical cancer HeLa cells through an intrinsic apoptotic pathway[J].Phytomedicine，2010，17(8/9)：598.

　　[3]Liu C， Li J， Meng F Y， et al. Polysaccharides from the root of Angelica sinensis promotes hematopoieses and thrombopoieses through the PI3K/AKT pathway[J].BMC Complemant Alternat Med，2010，10(79)：1186.

　　[4]何晓莉，关雪晶，吴宏，等.当归多糖对电离辐射致小鼠骨髓单个核细胞凋亡及氧化损伤的影响[J].重庆医科大学学报，2012，37(4)：315.

　　[5]Zhao L， Wang Y， Shen H L， et al. Structural characterization and radioprotection of bone marrow hematopoiesis of two novel polysaccharides from the root of Angelica sinensis(Oliv.) Diels[J].Fitoterapia，2012，83(8)：1712.

　　[6]张先平，王乾兴，王亚平，等.当归多糖抑制氧化损伤延缓造血干细胞衰老[J].中国中药杂志，2013，38(3)：407.

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