浅谈青霉素发酵生产工艺

发布时间：2011-09-13 09:48所属分类：药学论文浏览：1次加入收藏

青霉素是一种重要的抗生素，在目前的制药工业中占有举足轻重的地位，本文以青霉素发酵生产为主线，简单论述了从种子的制备到扩大生产至发酵罐这一流程，指出了青霉素发酵生产中各工艺点的控制，以及培养基的灭菌工艺。研究和优化其生产工艺对人类健康有重要意

浅谈青霉素发酵生产工艺
李 娅
摘 要：青霉素是一种重要的抗生素，在目前的制药工业中占有举足轻重的地位，本文以青霉素发酵生产为主线，简单论述了从种子的制备到扩大生产至发酵罐这一流程，指出了青霉素发酵生产中各工艺点的控制，以及培养基的灭菌工艺。研究和优化其生产工艺对人类健康有重要意义。
关键词：青霉素、培养基、灭菌、生产流程、过程控制

抗生素是由各类生物体包括微生物、植物、动物等在其生命活动过程中产生的一类天然有机化合物，具有低浓度下，有选择性的抑制或杀灭其他微生物和生物细胞的作用，目前抗生素仍被广泛的应用于各种疾病的治疗上。在众多抗生素类群中，青霉素以它独特的疗效高，毒副作用小成为人类治疗疾病的首选。
1.青霉素的概述
青霉素是抗菌素的一种，是指从青霉素培养液中提制的分子中含有青霉烷，能破坏细菌的细胞壁并在细菌的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。它作用于细胞壁合成中的肽多糖合成的第三阶段，线性肽多糖在转肽酶的催化下进行交联，肽多糖链之间每两条肽链结合时均释放出一个D－丙氨酸，青霉素中与肽多糖的D－丙胺酰－D－丙氨酸二肽相似，竞争性的与转肽酶结合，使转肽酶不能催化多肽链之间的交联。
根据青霉素菌种的不同，生产能力也有所不同，目前青霉素的生产能力可达66000－80000U/ml。
2、青霉素发酵生产工艺过程
2.1青霉素生产流程
原料→培养基配制→蒸汽灭菌→一级种子罐←米孢子←斜面母瓶←青霉素菌种
↓
原料→培养基配制→蒸汽灭菌→二级种子罐
↓
原料→培养基配制→蒸汽灭菌→ 发酵罐 →发酵液
↓
带放罐 →发酵液
2.2发酵工艺过程
（1）生产孢子的制备
将砂土保藏的菌种孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨组成的培养基进行斜面培养，经传代活化。最适生长温度在25~26 ℃，培养6~8天，得单菌落，再传斜面，培养7天，得斜面孢子。 移植到优质小米或大米固体培养基上，生长7天，25℃，制得小米孢子。 每批孢子必需进行严格摇瓶试验，测定效价及杂菌情况。
（2）种子罐和发酵罐培养工艺
种子培养要求产生大量健壮的菌丝体，因此，培养基应加入比较丰富的易利用的碳源和有机氮源。青霉素采用三级发酵 。一级种子发酵：发芽罐，接入小米孢子后，孢子萌发，形成菌丝。空气流量1：1－1.5；充分搅拌250－280r/min；pH自然，25±1℃；0－14h。 三级发酵罐：生产罐。培养基成分：花生饼粉（高温），麸质粉、玉米浆、葡萄糖，尿素，硫酸铵，硫酸钠、硫代硫酸钠，磷酸二氢钠，苯乙酰胺及消泡剂，CaCO3等。接种量为12~15%。青霉素的发酵对溶氧要求极高，通气量偏大，通气比控制0.7~1.8；搅拌转速150－200r/min；要求高功率搅拌。
2.3培养基的灭菌
在青霉素发酵过程中，培养基灭菌是否彻底也是发酵控制的关键。在青霉素生产中一般发酵培养基灭菌方式有连续灭菌(连消)和实罐灭菌（实消）两种。
连消是将配好的培养基用泵打入连消塔，通过高温蒸汽直接接触灭菌，在进入维持罐维持5分钟左右，然后进入冷却器进行冷却后进入发酵罐，连消具有培养基受热时间短、营养成分破坏少、发酵罐利用率高等优点。但存在对蒸汽供应要求高（蒸汽压力在0.4MPa以上，波动不能太大，否则灭菌不易彻底）、对设备和操作要求高（设备出现问题或操作不慎，容易造成大面积染菌）。这就要求在生产中加强巡检，确保设备的正常运行和管道没有跑、冒、滴、漏的现象，保证灭菌彻底。
在实际生产中实消也是比较常用的方法，实消是将配制好的培养基用泵打入发酵罐， 通入饱和蒸汽加热，达到灭菌温度（121℃）后，保温灭菌约30分钟，灭菌完毕通入无菌空气维持罐压，然后由内蛇管和外盘管通入冷却水，冷却到接种温度，保压待移种。培养基经灭菌后应尽快冷却至接种温度，冷却时间越长，培养基破坏程度越高。
2、发酵生产过程控制
青霉素采用反复分批式发酵，发酵过程需连续流加补入葡萄糖、硫酸铵以及前体物质苯乙酸盐，补糖率是最关键的控制指标，不同时期分段控制。
（1） 培养基的组成和补料控制
青霉素发酵中采用补料分批操作法，对葡萄糖、铵、苯乙酸进行缓慢流加，维持一定的最适浓度。
碳源的选择：生产菌能利用多种碳源，乳糖，蔗糖，葡萄糖，阿拉伯糖，甘露糖，淀粉和天然油脂。糖与6-APA结合形成糖基-6-APA，影响青霉素的产量。葡萄糖、乳糖结合能力强，而且随时间延长而增加。所以通常采用葡萄糖和乳糖。
氮源：玉米浆是最好的，是玉米淀粉生产时的副产品，含有多种氨基酸及其前体苯乙酸和衍生物。玉米浆质量不稳定，可用花生饼粉或棉籽饼粉取代。补加无机氮源。
无机盐：硫、磷、镁、钾等。铁有毒，控制在30ug/ml以下。
流加控制：补糖，根据残糖、pH、尾气中CO2和O2含量。残糖在0.6％左右，pH开始升高时加糖。
补氮：流加酸酸铵、氨水、尿素，控制氨基氮0.05%。
添加前体：合成阶段，苯乙酸及其衍生物，苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等均可为青霉素侧链的前体，直接掺入青霉素分子中。也具有刺激青霉素合成作用。但浓度大于0.19％时对细胞和合成有毒性。还能被细胞氧化。策略是流加低浓度前体，一次加入量低于0.1%，保持供应速率略大于生物合成的需要。
（2）温度
温度对微生物的影响是多方面的。首先，温度影响酶的活性。在最适温度范围内，随着温度的升高，菌体生长和代谢加快，发酵反应的速率加快。生产中采用变温控制，不同阶段不同温度。前期控制25－26℃左右，有的发酵过程在菌丝生长阶段采用较高的温度，以缩短生长时间，生产阶段适当降低温度，以利于青霉素合成。
（3）pH
PH能影响酶的活性，以及细胞膜的带电荷状况。细胞膜的带电荷状况如果发生变化，膜的透性也会改变，从而有可能影响培养基中营养物质的吸收及代谢产物的分泌。此外，PH还会影响培养基中物质的分解等。因此，控制发酵液的PH是很重要的。青霉素发酵也只有在合理的PH和溶氧下，生产和发酵才会达到最高效率，前期pH控制在5.7~6.3，中后期pH控制6.3~6.6，通过补加氨水进行调节。目前，在发酵过程中利用PH电极，用于连续测定和记录PH变化。
（4）溶氧
青霉素发酵属于好氧发酵，氧的供应对好氧发酵来说，是一个关键因素。从葡萄糖的氧化的需氧量来看，1mol的葡萄糖彻底氧化分解，需6mol的氧；所以不能低于30％饱和溶氧浓度。通气比一般为1：0.8VVM。在罐的夹层或蛇管中需通冷却水以维持一定的罐温，在整个发酵过程中，需不断通入无菌空气和搅拌，以维持一定的罐压或溶氧。适宜的搅拌速度，保证气液混合，提高溶氧，根据各阶段的生长和耗氧量不同，对搅拌转速调整。
（4）菌丝生长速度与形态、浓度
对于每个有固定通气和搅拌条件的发酵罐内进行的特定好氧过程，都有一个使氧传递速率（OTR）和氧消耗率（OUR）在某一溶氧水平上达到平衡的临界菌丝浓，超过此浓度，OUR＞OTR，溶氧水平下降，发酵产率下降。在发酵稳定期，湿菌浓可达15~20%，丝状菌干重约3%，球状菌干重在5%左右。另外，因补入物料较多，在发酵中后期一般每天带放一次，每次放掉总发酵液的10%左右。
（5）消沫
青霉素发酵过程中，由于通气搅拌、微生物的代谢过程及培养基中某些成分的分解等，都有泡沫产生。发酵过程中产生一定数量的泡沫是正常现象，但过多的持久性泡沫对发酵是不利的，因为泡沫会占据发酵罐的容积，降低产量，影响通气和搅拌的正常进行，甚至导致代谢异常，因而需补入消沫剂。通常用的有两种，一种是天然油脂：玉米油；一种是化学消沫剂：泡敌。需少量多次滴加。不适在前期多加入，以免影响呼吸代谢。
（6）取样
青霉素的发酵过程控制十分精细，一般2 h取样一次，测定发酵液的pH、菌浓、残糖、残氮、苯乙酸浓度、青霉素效价等指标，同时取样做无菌检查。
3、结语
迄今为止，人们对青霉素合成的了解还十分肤浅，大部分机理仍还无法阐述清楚，然而可以预计，随着对青霉素发酵过程和代谢途径的不断深入，人们一定能够找到某种适当的方法来解决青霉素合成中的阻遏因素，从而大幅提高青霉素的效价和产量。

参考文献：
[1] 刘振宇，发酵工程技术与实践 上海：华东理工大学出版社，2007.1
[2] 何建勇，发酵工艺学 北京：中国医药科技出版社2009.8
[3] 齐香君，现代生物制药工艺学 北京：化学工业出版社 2010.3

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