成都医学院学报投稿药学论文
发布时间：2013-12-19 09:12所属分类：药学论文浏览：1次加入收藏
本文是一篇药学论文范文，选自期刊《 成都医学院学报 》，同类期刊推荐《南通大学学报》（医学版），本刊主要刊载本院及教学医院和全国交通系统医疗卫生单位，在基础医学和临床基学、预防医学、中医学和航海医学等方面的最新成果和有一定学术水平的医学论文
本文是一篇药学论文范文，选自期刊《成都医学院学报》，同类期刊推荐《南通大学学报》（医学版），本刊主要刊载本院及教学医院和全国交通系统医疗卫生单位，在基础医学和临床基学、预防医学、中医学和航海医学等方面的最新成果和有一定学术水平的医学论文。
【摘要】目的探讨褪黑素对癫痫发作中细胞凋亡的影响。方法将24只成年Wistar大鼠(180～230g)随机分为NC组、PTZ组和MT组；PTZ组和MT组腹腔注射PTZ(60mg/kg)，诱导癫痫发作，NC组腹腔注射等量生理盐水。MT组按体重10mg/kg于注射PTZ之前20min、立即、后1h、后2h分别经腹腔注射MT并观察1h，PTZ组于相同时间注射生理盐水。然后处死大鼠取脑，应用免疫组织化学的方法检测海马神经元Bax和Bcl-2蛋白的表达。结果大鼠海马神经元Bax的改变：PTZ组明显高于NC组，MT组明显低于PTZ组，但高于NC组：大鼠海马神经元Bcl-2的改变：PTZ组明显高于NC组，MT组明显高于PTZ组，也高于NC组。结论MT可以通过增强海马神经元Bcl-2的表达和降低Bax的表达而对抗癫痫中细胞的凋亡。
【关键词】褪黑素,癫痫,戊四氮,Bax,Bcl-2
难治性癫痫是神经系统的常见病，发病机制至今没有完全阐明，癫痫长期发作可能造成患者的智力和认知发生改变，给社会和家庭带来沉重的负担。大量动物实验发现癫痫发作后中枢神经系统存在细胞凋亡，临床癫痫病人也大多有海马硬化存在。褪黑素(Melatonin，MT)是松果体分泌的神经内分泌激素，它对人体的作用非常广泛，近年研究发现它具有抗癫痫发作的报道［1］，但是它是否对癫痫发作后神经细胞的凋亡具有保护作用研究较少，本实验旨在通过观察MT对戊四氮(pentylenetetrazole，PTZ)点燃大鼠海马神经元的Bcl-2和Bax的影响，借以了解其对神经元细胞凋亡的保护作用，弄清它在治疗癫痫中的进一步作用机制。
1材料与方法
1.1材料戊四氮及多聚甲醛均为Sigma公司产品，兔抗Bcl-2和Bax抗体购自北京中山试剂有限公司，Wistar大鼠由华中科技大学同济医学院动物中心提供，羊抗兔抗体和DAB染色剂购自武汉博士德公司，褪黑素购自Alexis公司。
1.2MT的制备MT临用前用无水乙醇溶解，再加生理盐水配制，使乙醇的浓度为5%。
1.3动物饲养与分组提前1w将大鼠饲养在12h光照(7：00～19：00)12h黑暗(19：00～7：00)安静的环境，自由摄食进水，24只健康雄性Wistar大鼠(320～380g)，随机分为三组：一组为PTZ致癫痫组(PTZ组)；一组为MT干预组(MT组)；一组为正常对照组(NC组)，每组8只。PTZ组和MT组各8只，经腹腔注入戊四氮(60mg/kg)诱导癫痫发作，并观察行为学变化。MT组按体重10mg/kg于注射PTZ之前20min、注射后立即、后1h、后2h分别经腹腔注射MT并观察1h，PTZ组于相同时间注射等量含5%乙醇生理盐水。然后，3组全部行心脏灌注固定取材。
1.4灌注与取材动物先用10%的水合氯醛(0.3g/kg)腹腔注射麻醉，麻醉显效后开胸在直视下将穿刺针自左心室插入主动脉，自右心房剪口放血，先快速注入约150ml生理盐水，然后滴注4%的多聚甲醛500ml，先快后慢，持续约1h，然后断头取脑，取出脑组织后修块(含海马)，将组织块放入4%多聚甲醛中，2～4h后取出，放入20%的蔗糖中过夜，常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，片厚4μm。
1.5免疫组织化学方法(S-P法)每只动物取8张脑片，4张用于Bax，4张用于Bcl-2。具体步骤如下：(1)切片常规脱腊入水，PBS(pH7.4)洗3次，每次3min。(2)高压修复抗原，将切片浸入0.01M的枸橼酸缓冲(pH6.0)，高压加热，喷气后2min。(3)每张切片滴加1滴过氧化酶阻断溶液，37℃孵育10min，以阻断内源性过氧化酶的活性。PBS洗3次，每次3min。(4)每张切片滴加1滴正常山羊血清封闭液，室温孵育15min。(5)每张切片滴加1滴兔抗Bax和Bcl-2抗体，4℃过夜。(6)PBS洗三次，每次3～5min。(7)除去PBS液，每张切片滴加1滴链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，37℃孵育25min。PBS洗三次，每次3min。(8)除去PBS液，每张切片滴加2滴新鲜配置的DAB溶液，显微镜下观察3min。(9)自来水冲洗，苏木素复染，PBS冲洗返蓝。(10)切片经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。
1.6图像分析和数据处理每只鼠取8张脑片，其断面水平各鼠均相似，应用HPIAS200彩色病理图文分析管理系统进行图像分析。所有脑片均在同一放大倍数(×200)、同一光强度下分析。首先分析海马内Bax和Bcl-2平均阳性细胞计数，然后对所选脑区进行阳性反应细胞平均光密度测定。
1.7统计学处理结果用x±s表示。应用SAS统计软件包分析(医院统计室提供)。
2结果
2.1行为学变化PTZ组在注射戊四氮后平均1.5min出现眨眼、动须、节律性点头、肢体抽搐、跌倒等，其中8只出现Ⅴ级发作。MT组在给药后平均12min出现眨眼、动须、节律性点头、肢体抽搐、跌倒等表现，2只出现Ⅴ级发作，3只出现Ⅳ级发作，1只出现Ⅲ级发作，1只出现Ⅱ级发作。行为学的判断标准按Racine法分为Ⅰ级：湿狗样颤动，面肌抽动、咀嚼；Ⅱ级：节律性点头；Ⅲ级：前肢阵挛；Ⅳ级：站立伴前肢阵挛；Ⅴ级：失平衡、倾倒、四肢抽动、全身阵挛。
2.2免疫组织化学结果海马Bax和Bcl-2平均阳性细胞计数，胞体平均光密度值见表1和表2，免疫反应的强弱用平均光密度值表示，颜色越深数值越大。PTZ组Bax平均阳性细胞计数和胞体平均光密度明显高于正常对照组，MT组明显低于PTZ组，但高于NC组。PTZ组bcl-2平均阳性细胞计数和胞体平均光密度明显高于NC组，VAP组明显高于PTZ组，也高于NC组。
表1海马bax阳性细胞平均数目(N)和光密度(D)的比较(x±s)
注：*P＜0.01comparedwithNCgroupandPTZgroup，
**P＜0.05comparedwithNCgroup
表2海马bcl-2阳性细胞平均数目(N)和光密度(D)的比较(x±s)
注：*P＜0.01comparedwithNCgroupandPTZgroup，
**P＜0.05comparedwithNCgroup
3讨论
细胞凋亡是能量依赖的细胞内死亡程序活化而致的“程序性细胞死亡”，是细胞的一种生理性、主动性的“自觉自杀行为”。神经系统发育过程中凋亡现象普遍存在。在许多中枢神经系统疾病中，神经细胞的死亡也涉及凋亡机制，癫痫是神经系统的常见病，癫痫长期发作可以造成患者的智力和认知功能发生改变，其中主要是与癫痫发作导致神经元损害有关，因此临床发现癫痫病人大多有海马硬化存在。大量动物实验发现癫痫发作过程中造成的海马神经细胞的损害可诱导典型的凋亡现象发生［2］。细胞凋亡与许多基因表达密切相关，有促进凋亡的基因，如Bax；也有某些基因的表达可使细胞抗凋亡能力增强如Bcl-2。Bcl-2可以与Bax结合形成Bcl-2/Bax异二聚体，阻止Bax插入线粒体外膜，保护线粒体电势梯度，调节细胞内Ca2+的自稳状态和氧化还原状态等多方面来抑制凋亡［3］。本研究发现，癫痫发作后Bcl-2、Bax蛋白表达阳性率明显升高，而正常对照组仅有少量表达，说明癫痫发作可以激发内源性的抗凋亡机制，但是这种保护机制是有限的，长期癫痫发作必将导致大量细胞的死亡，海马硬化。因此探讨有效的抗凋亡机制在保护癫痫发作后的神经元的死亡，提高患者的生活质量，减轻家庭和社会的负担具有重要的意义。
褪黑素是松果体腺分泌的一种激素，人体的褪黑素主要来源于松果体腺的分泌。此外，视网膜及胃肠道等组织也可合成褪黑素。其生理作用是调节季节性节律和昼夜节律，此外它还具有镇静、催眠、镇痛、抗抑郁、抗惊厥、调节免疫反应、延缓衰老及调节生殖系统的生长发育等多种生理功能。目前，褪黑素对肿瘤、老年性疾病、心血管疾病和癫痫等的作用机理研究，已成为科学家们关注的热点。Reiter等［4］研究发现褪黑素可以明显抑制海仁酸所诱导的癫痫发作；我们的实验研究也发现褪黑素可以明显减轻戊四氮所诱导的癫痫发作，使发作的程度减轻，发作的时间缩短。因此褪黑素可以作为一个潜在的抗癫痫药物。并且我们的研究还发现，它还可以诱导Bcl-2蛋白的表达，抑制Bax蛋白的表达，使Bcl-2/Bax的比值升高，稳定线粒体膜，从而发挥抗细胞凋亡的作用。其上调Bcl-2和下调Bax表达的具体机制不是很清楚，可能与以下因素有关：(1)MT具有高效的自由基清除能力，可清除体内多种自由基，从而抑制自由基所诱导的Bax的上调表达［5］。(2)褪黑素能够抑制MDA的产生，减轻氧化损伤所诱导的Bax的上调表达。(3)抑制NF-κB的表达，从而抑制Bax的上调表达［6］。(4)褪黑素可以使细胞内的GABA的浓度升高，兴奋性氨基酸(谷氨酸)的浓度降低，使Bcl-2的表达升高。(5)阻止Ca2+通道，抑制线粒体内Ca2+超载所诱导的Bax的表达增加所触发的细胞凋亡。
总之，褪黑素作为一个潜在的抗癫痫药物，不仅能够控制痫性发作，它还可以通过多种途径抑制细胞的凋亡，减轻癫痫发作所诱导的细胞损伤。
【参考文献】
1MohananPV，YamamotoHA.PreventiveeffectofmelatoninagainstbrainmitochondriaDNAdamange，lipidperoxidationandseizuresinducedbykainicacid.Tocicollett，2002，129(1-2)：99-105.
2李震中，阮旭中，白欣立，等.癫痫持续状态后海马神经元凋亡的形态学证据.脑与神经疾病杂志，1996，4(4)：207.
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