医学校验论文人血浆中甲氨蝶呤的测定

发布时间：2014-04-21 08:51所属分类：医学校验论文浏览：1次加入收藏

大剂量甲氨蝶呤-甲酰四氢叶酸钙（Methotrexate-citrovorumfactor，MTX-CF）解救是目前防治儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）髓外浸润的主要措施。在该方案实施过程中，MTX血药浓度个体差异较大，患者体内的MTX血药浓度过高和持续时间过长是导致其细胞毒性作用的

　　大剂量甲氨蝶呤-甲酰四氢叶酸钙（Methotrexate-citrovorumfactor，MTX-CF）解救是目前防治儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）髓外浸润的主要措施。在该方案实施过程中，MTX血药浓度个体差异较大，患者体内的MTX血药浓度过高和持续时间过长是导致其细胞毒性作用的直接原因，而且MTX特异性差，除对肿瘤细胞产生毒性外，对所有快速分裂的正常细胞也有严重毒性。

　　摘要：建立反相高效液相色谱法测定甲氨蝶呤血药浓度的方法，以指导临床合理用药。采用AgilentZOBAXSB-C18柱（150mm×4.6mm，5μm）；流动相为0.025mol/L磷酸二氢钠溶液（pH6.30）-甲醇（76/24，V/V）；流速为1.00mL/min；检测波长为313nm；柱温为35℃；10%（V/V）高氯酸为蛋白沉淀剂。结果表明，血浆中甲氨蝶呤浓度在0.05～5.00μg/mL（Y1=35.556C+0.771，r=0.9999）和5.00～100.00μg/mL（Y2=36.727C+1.700，r=0.9999）范围内与峰面积呈良好线性关系，平均回收率为99.03%和97.04%。日内精密度小于1%，日间精密度小于2.5%（n=6），定量浓度为0.05μg/mL。该方法色谱条件稳定、操作简单、出峰时间快、线性范围宽、精密、准确、特异性强、回收率高，适用于甲氨蝶呤血药浓度的监测。

　　关键词：医学校验论文,反相高效液相色谱法,甲氨蝶呤,血药浓度

　　因此及时监测MTX的血药浓度对确保临床用药的安全有效具有重要意义。本试验参考文献[1-6]，优化了测定血浆中MTX的RP-HPLC法，该法样品预处理简单、线性范围宽、分离效果好、色谱峰对称、灵敏度高、结果稳定可靠，可为分析人血浆中的MTX提供参考。

　　1材料与方法

　　1.1材料与试剂

　　血浆样品由赣南医学院提供。

　　甲氨蝶呤对照品（批号100138-200603）购自中国药品生物制品检定所；甲醇为色谱纯，磷酸二氢钠、高氯酸、氢氧化钠等均为分析纯。

　　1.2仪器

　　AgilentHPLC1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；ChemStationRevision化学工作站；XW-80A型旋涡混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；BS224S型电子天平（德国赛多利斯股份公司）；原子Ⅱ型超纯水机（美国艾柯公司）；PB-10型pH计（德国赛多利斯股份公司）；

　　1.3方法

　　1.3.1色谱条件流动相为0.025mol/L磷酸二氢钠溶液（pH6.30）-甲醇（76/24，V/V），流速1.00mL/min，检测波长313nm，柱温35℃，10%（V/V）高氯酸为蛋白沉淀剂，进样量20μL。

　　1.3.2溶液配制称取经100℃减压干燥至恒重的MTX对照品0.0250g，以去离子水定容至25mL，得1000μg/mL对照品贮备液；将对照品贮备液以去离子水稀释，配制成1～1000μg/mL系列浓度溶液。同法配制1.1、10.5、42.2、105.0、422.0和844.0μg/mL的质控溶液。

　　1.3.3血浆样品预处理吸取300μL血浆，置1mL离心管中，加入300μL10%高氯酸，旋涡混合3min，离心20min（14000r/min，4℃），取上清液300μL，加入适量1mol/L氢氧化钠溶液调溶液pH至中性，涡旋30s，吸取上清液20μL进样分析。

　　2结果与分析

　　2.1色谱分析

　　在本试验条件下，样品处理方法简单，分离度良好，峰形对称，血浆中内源性杂质对MTX测定无干扰，MTX保留时间为3.28min，见图1。

　　2.2标准曲线绘制

　　2.3回收试验分析

　　精确吸取质控溶液适量，加入空白血浆配制成质量浓度分别为0.11、1.05、4.22、10.50、42.20、84.40μg/mL的质控血浆样品，按样品处理方法操作，测定血药浓度，计算回收率，结果见表1。由表1可知，该方法准确度较高。

　　2.4精密度分析

　　2.5稳定性分析

　　将已知浓度的MTX血浆样品分别置于室温和4℃冷藏条件下避光保存3、6、12、24、36、48h，分别测定其含量。结果表明，1.05μg/mLMTX血浆样品在室温条件下至少能稳定12h（1.0442±0.0031，RSD=0.2969%），在4℃冷藏条件下至少能稳定48h（1.0438±0.0038，RSD=0.3161%）。

　　2.6临床应用分析

　　监测2011-2012年入赣南医学院附属医院血液科的15例使用大剂量MTX的所有患者的血药浓度，结果见表3。

　　有报道称MTX用量可至1～10g/m2[7]，故在监测MTX血药浓度的条件下，可适当增加用量，以保证临床疗效。一般认为46h和72h时的MTX血药浓度反映了MTX在体内的排泄情况指标，关系到CF解救剂量和解救次数的选择，通常将MTX血药浓度46h<0.5μg/mL、72h<0.05μg/mL作为安全浓度，超过上述浓度应追加CF解救。本院治疗期间的所有患者，经过及时血药浓度监测，未出现严重不良反应，多为Ⅱ度胃肠道反应。

　　3小结与讨论

　　血样处理方法的选择直接影响RP-HPLC法的检测效果。常用的MTX血样处理方法有液-液萃取法和直接沉淀法[8]，其中直接沉淀法简便、高效。采用直接沉淀法处理MTX血样时，沉淀剂的选择至关重要。MTX不溶于甲醇，其提取回收率过低；在乙腈中紫外吸收下降；用三氯乙酸则血浆杂质峰较多，故这3种溶剂都不宜用作蛋白沉淀剂。本试验参考文献[9，10]，以10%高氯酸为蛋白沉淀剂，采用氢氧化钠中和上清液，该方法可明显改善高氯酸造成的基线漂移，并能防止强酸对进样器腐蚀并保护色谱柱。本法最低定量检测浓度为0.05μg/mL，能够满足日常临床监测要求。高氯酸用量对MTX的回收率影响较大，当加入高氯酸的量与血浆体积比为1∶1时，对蛋白质的沉淀才相对完全。此外，在离心处理沉淀时，血浆蛋白对MTX具有较强的吸附作用，因此离心转速以及时间对蛋白质的相对完全沉淀都有重要影响。

　　本试验采用反相高效液相色谱法测定血浆中MTX的质量浓度，所需样本量少、结果稳定、操作简单快速、线性范围宽、结果精密准确、回收率高。该法已应用于我院儿科白血病患者MTX血药浓度的监测，效果良好。

　　参考文献：

　　[1]霍晶，袁盛华，方芸，等.反相高效液相色谱法测定人血浆中甲氨蝶呤的浓度[J].药学与临床研究，2007，15（5）：390-392.

　　[2]李碧峰，惠平，贾晋蓉，等.反相高效液相色谱法测定血浆中甲氨蝶呤的质量浓度[J].中国药业，2010，19（19）：7-8.

　　[3]周卿，潘雪君.固相萃取-高效液相色谱法测定人乳中甲氨蝶呤的含量[J].药物分析，2011，31（12）：2305-2307.

　　[4]程斌，林能明，方罗.RP-HPLC测定人体血浆中甲氨蝶呤的浓度[J].药物分析，2006，26（5）：598-560.

　　[5]毛永连，王峰.高效液相色谱法测定人血浆中甲氨蝶呤的浓度[J].中南药学，2008，12（6）：678-680.

　　[6]莫小兰，王伟华，温预关，等.低剂量甲氨蝶呤给药类风湿性关节炎病人血浆浓度的测定[J].临床药学，2009，9（5）：26-30.

　　[7]李黎波，李金翰，徐峰.大剂量甲氨蝶呤静滴后解救剂甲酰四氢叶酸钙的个体化用药[J].实用癌症杂志，1995，10（4）：261-263.

　　[8]吴闯，杨正鸿，林贵业，等.反相高效液相色谱法测定血浆和脑脊液中甲氨蝶呤浓度[J].中国医院药学杂志，1999，19（5）：272-274.

　　[9]李明艳，吴洪文.内标法测定甲氨蝶呤血药浓度及其在小剂量甲氨蝶呤应用的监测[J].中国药物警戒，2010，7（4）：196-198.

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