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发布时间：2014-06-20 15:00所属分类：基础学论文浏览：1次加入收藏

黑色素瘤又称恶性黑色素瘤，是由异常黑素细胞的过度增生所引发的一种常见的皮肤肿瘤。中国虽属黑色素瘤的低发区，但近年来，恶性黑色素瘤发病的增长率呈逐年上升的趋势，它转移早、进展快、预后差、死亡率高，现今仍未发现治疗黑色素瘤较好的药物[1]。随着中

　　黑色素瘤又称恶性黑色素瘤，是由异常黑素细胞的过度增生所引发的一种常见的皮肤肿瘤。中国虽属黑色素瘤的低发区，但近年来，恶性黑色素瘤发病的增长率呈逐年上升的趋势，它转移早、进展快、预后差、死亡率高，现今仍未发现治疗黑色素瘤较好的药物[1]。随着中药成分抗肿瘤的不断研究发展，部分中药活性成分已在临床抗肿瘤实践中取得令人满意的疗效，这也为黑色素瘤的治疗药物研发指明了方向。

　　[摘要]目的：探讨新藤黄酸诱导黑色素瘤B16细胞凋亡的机制。方法：MTT试验检测新藤黄酸对B16细胞增殖抑制的作用；采用Hochest33258荧光染色观察新藤黄酸对B16细胞的影响；透射电镜观察新藤黄酸对B16细胞的超微结构的改变；Westernblot法检测PI3K，p-PI3K，Akt，p-Akt，p-mTOR，PTEN蛋白的变化以探讨新藤黄酸诱导B16细胞凋亡的分子机制。结果：新藤黄酸对黑色素瘤细胞B16生长和增殖有明显地抑制作用，并随着新藤黄酸浓度的增加和作用时间的延长细胞活力明显下降；Hochest33258染色结果显示，新藤黄酸处理的细胞中呈现明显的凋亡特征；透射电镜观察发现新藤黄酸作用B16细胞后，细胞发生明显凋亡的形态学变化；Westernblot检测表明p-PI3K蛋白表达呈时间依赖性下降；p-Akt蛋白表达呈时间依赖性下降，而PI3K，Akt蛋白表达量基本不变，p-mTOR蛋白的表达随着时间的延长有所下降，PTEN蛋白的表达呈时间依赖性增加。结论：新藤黄酸在一定的时间和浓度范围内能够抑制黑色素瘤B16细胞的增殖，诱导细胞凋亡，其诱导细胞凋亡的机制可能与调控PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。

　　[关键词]月期刊网,新藤黄酸,细胞凋亡,B16,分子机制

　　藤黄系藤黄科植物所分泌的干燥树脂，据古代医书记载，藤黄味酸涩、有毒，具有攻毒蚀疮、破血散结等功效。主治痈疽、肿毒、顽癣、恶疮、跌打损伤、创伤出血及烫伤。现代中医临床也广泛用于治疗癌症、疮疡、毛囊炎等[2]。新藤黄酸（GNA）是藤黄中主要成分之一，近年来研究表明，新藤黄酸具有良好的抗肿瘤活性[3-5]，抗癌谱广。且藤黄作为治疗皮肤疾患的中药使用由来已久，本研究在前期工作的基础上拟以小鼠皮肤黑色素瘤B16细胞作为研究对象，探讨新藤黄酸对B16细胞诱导凋亡的可能机制。

　　1材料

　　1.1细胞株黑色素瘤B16细胞来源于ATCC（美国国立细胞库），中国科学技术大学生命科学院惠赠。细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中于37℃，5%CO2条件下培养，选取对数生长期细胞进行实验。

　　1.2材料DMEM（Gibco公司）；胎牛血清（ThermoFisherscientific公司）；胰蛋白酶（Amersco公司）；Akt，β-actin，PI3K，p-PI3K购自CruzBiotechnology（SantaCruz，CA，USA）；Phospho-Akt（Ser473），PTEN和p-mTOR购自CellSignaling（CellSignalingTechnology，MA，USA）；ECL发光试剂盒（Thermo公司）。

　　1.3仪器超净工作台（苏净集团安泰公司）；SpectraMaxM5多功能酶标仪（美国MD公司）；Hitachi-600透射电子显微镜（日本日立）；DMI-6000B倒置荧光显微镜（德国徕卡）。

　　2方法

　　2.1MTT试验取对数生长期的小鼠黑色素瘤B16细胞，消化收集细胞并将细胞调整为6×104个/mL的悬液，再接种于无菌的96孔板中，每孔100μL，实验设6个复孔，并设空白对照组。接种，培养过夜，镜下观察确认细胞贴壁良好。实验组加入不同浓度的新藤黄酸溶液（0，0.75，1.5，3.0，6.0，12μmol・L-1），细胞在培养箱中分别培养24，48，72h。结束培养前4h小心吸去细胞培养液，每孔加入MTT溶液20μL，37℃继续培养4h，每孔再加入DMSO150μL，振荡20min，混匀。570nm波长酶标仪检测每孔吸光度A，实验重复3次。按照公式计算抑制率（IR）=（A阴性对照-A实验组）/A阴性对照×100%。

　　2.2Hochest33258荧光染色将处于对数生长期的B16细胞以8×104个/孔接种到6孔板中，每孔分别加入2mL细胞培养基。于种板后24h，吸弃各孔中的培养液，新藤黄酸处理组各孔中分别加入含新藤黄酸1.5，3.0，6.0μmol・L-1的培养基3mL，对照组加入完全培养基3mL。置37℃恒温培养箱中孵育24h后，弃各孔中培养基，PBS（pH7.4）冲洗细胞，共2次，每次5min；加入1～2mL2%多聚甲醛固定10min，弃多聚甲醛，PBS缓冲液漂洗细胞3次，每次5min。再加入l0g・L-1Hoechst33258在37℃下避光孵育lh，最后PBS缓冲液轻洗细胞，5min1次，倒置荧光显微镜下观察并拍照。

　　2.3透射电子显微镜观察黑色素瘤B16细胞超微结构B16细胞接种于6孔板，过夜后再加1.5，3.0，6.0μmol・L-1新藤黄酸处理24h，空白对照组加完全培养基继续培养。胰酶消化后离心收集细胞，预冷的PBS洗2遍，细胞团块用2.5%戊二醛4℃固定12h以上，制备超薄切片，枸橼酸铅染色，透射电镜下观察并摄片。

　　2.4Westernblot检测蛋白变化B16细胞在3.0μmol・L-1新藤黄酸作用6，12，18，24h后提取细胞总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。10%～15%分离胶和5%浓缩胶进行SDS-PAGE电泳，然后将蛋白转移至硝酸纤维素膜。以5%脱脂奶粉封闭，4℃一抗孵育过夜。PBST洗涤3次，每次10min。再加HRP标记的二抗稀释液室温孵育2h，PBST洗涤3次，每次10min。ECL试剂盒显影，Bio-Rad凝胶成像系统采集图片

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