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发布时间：2014-06-20 15:02所属分类：基础学论文浏览：1次加入收藏
骨质疏松症是以骨组织显微结构受损，骨矿成分和骨基质等比例的不断减少，骨质变薄，骨小梁数量减少，骨脆性增加和骨折危险度升高的一种全身骨代谢障碍的疾
骨质疏松症是以骨组织显微结构受损，骨矿成分和骨基质等比例的不断减少，骨质变薄，骨小梁数量减少，骨脆性增加和骨折危险度升高的一种全身骨代谢障碍的疾病。抗骨质疏松药物越来越受到重视。
[摘要]目的：提出以二维斑马鱼模型联合色谱技术突破评价模型和化合物数量制约，建立高效筛选中药抗骨质疏松活性成分新方法。方法：根据本课题组相关研究及国外有关文献资料，依据斑马鱼骨质疏松模型可高效评价活性，斑马鱼代谢模型可高效富集代谢产物，现代色谱联用技术可高效分离、分析中药成分，提出三者有机联合有望高效解码中药抗骨质疏松体内、外药效物质。结果与结论：该方法使中药成分特别是量微成分与代谢产物的富集、分离分析、在体抗骨质疏松活性筛选简单、高效，充分体现中药药效物质含原形成分及代谢产物，具“多成分，多靶点，整体作用”的特点，为中药抗骨质疏松活性成分的早期、快速发现提供新思路与方法。
[关键词]中医学职称论文,斑马鱼,骨质疏松,药物代谢,色谱联用,活性筛选
但中药成分特别是量微成分的抗骨质疏松活性筛选尚难以简单、高效的进行，主要存在2个瓶颈问题：一是评价模型问题，现有哺乳动物骨质疏松模型耗时长，样品用量大，劳动强度大，效率低，不适于活性高效筛选；现有成骨、破骨细胞以及肿瘤细胞替代模型作用环节单一，难以体现整体观；此外，成本高，实验条件相对苛刻，原代细胞培养难度增加，普通实验室难以进行。二是化合物的数量问题，由于中药成分复杂，药效成分包括原形成分和代谢成分，很难分离到能满足在体活性评价所需的足量化合物，且量微成分及体内代谢成分的富集、分离难度更大。如何突破二者制约，实现中药成分特别是量微成分及其代谢物的抗骨质疏松活性高效筛选具有重要意义。
1斑马鱼骨质疏松模型有望突破量微成分难以进行在体评价的技术瓶颈
斑马鱼是近年来被广泛用于高通量药效筛选的重要工具。用糖皮质激素诱导的斑马鱼骨质疏松模型，具有化合物用量少（μg～mg），简单、高效、高灵敏及低成本的优势，可有效用于中药成分特别是量微成分及其复杂体系的抗骨质疏松活性评价。
1.1斑马鱼骨质疏松模型的依据与国内、外研究现状斑马鱼与哺乳动物骨骼生长发育的分子机制极为相似，斑马鱼的骨骼是从3种胚胎干细胞系发育而来，幼鱼骨包含骨形成和骨吸收活动所需的细胞。骨骼形成机制也包括软骨内骨化和膜内骨化，参与调控的关键基因，如Runx2，osteonectin，osteoprogerin等与哺乳动物的相关基因具有高度的同源性[1]。
2005年，Fleming等通过对加药后斑马鱼头部骨骼的发育观察，证明斑马鱼模型可以用于筛选促进骨骼发育的药物（维生素D3、依替膦酸等）[2]，之后Fleming等用糖皮质激素氢化泼尼松（prednisolone）诱导并建立斑马鱼骨质疏松模型，并证实目前抗骨质疏松常用药物依替膦酸（etidronate）和阿仑唑奈（alendronate）在斑马鱼模型中同样具有明显药效[3-4]。至此，斑马鱼作为高效、快速、高通量筛选促进骨骼生长、治疗骨科疾病药物的在体模型受到研究人员关注[5-7]。目前，斑马鱼骨质疏松模型已被做为比较成熟的、认可的一种在体动物模型用于药物（如licochalconeA）抗骨质疏松作用评价[8]。
在国内，斑马鱼做为新型骨骼研究模式生物模型已受到关注[9]，本课题组依据国内、外的相关研究基础，提出建立模式生物斑马鱼中药壮骨效应评价新模型。已成功建立糖皮质激素地塞米松和泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松模型，并用于评价依替膦酸二钠及淫羊藿、续断代表成分的抗骨质疏松活性（图1）[10-12]。
1.2斑马鱼骨质疏松模型的特色与优势①用样量少、灵敏度高：药物质量浓度μg・L-1～mg・L-1，μg～mg样品足够实验；②高通量：实验在微孔板进行，适合批量筛选；③简单、高效：实验条件简单、易控、易普及；耗时短，约为7～9d；④成体低：约是大鼠的1/1000；⑤环境条件要求低：不需要超净室，一般具有空调的普通实验室即可进行。
2斑马鱼代谢模型可有效用于量微成分的在体代谢，益于代谢产物的高效富集
中药体内成分含量低，常采用体外代谢模型富集代谢产物，如肝细胞、微粒体、代谢酶及肠菌转化等。但肝细胞、微粒体和代谢酶制备相对复杂，保持生物活力条件要求高，肠菌转化基质复杂，不利于代谢产物的进一步纯化，且体外模型作用环节相对单一。斑马鱼代谢模型简单、高效，能模拟哺乳动物进行I相，Ⅱ相及肠菌代谢及其综合作用，为代谢产物的富集提供新方法、新选择。
2.1斑马鱼代谢模型的依据与国内、外研究现状斑马鱼具有完整的器官系统和与哺乳动物相似的基因，具有药物代谢的相关酶系如I相代谢细胞色素P450酶和Ⅱ相代谢的葡萄糖醛酸转移酶及硫酸转移酶等，此外尚含肠菌代谢的肠道菌群，为其用于药物代谢研究提供了有力依据[13]。
本课题组提出“基于模式生物斑马鱼模型的中药代谢研究新方法的建立”，获得国家自然科学基金项目支持。建立了斑马鱼药物代谢的简单、可行方法：将斑马鱼置于含有20～30mL溶液的玻璃瓶中，则鱼会通过皮肤和腔道自主连续的从溶液中吸收药物，药物的代谢物也会随着斑马鱼的排泄物被连续的排到水中，定时取药液或鱼体，采用LC-MS分析代谢产物，可全面掌握代谢信息。
将该方法用于丹参中二萜醌类单体、单体组合物及总丹参酮的代谢，结果发现丹参二萜醌类化合物的脱氢与羟基化的I相代谢反应，这与现有代谢结论（大鼠体内、肝微粒体、细胞色素P450）的代谢机制一致；进一步研究表明，斑马鱼也可用于Ⅱ相代谢及肠菌代谢研究，且能体现多种代谢途径的综合结果：斑马鱼能使5-羟基黄酮、7-羟基黄酮及白杨素（5，7-二羟基黄酮）发生硫酸化和葡萄糖醛酸化的Ⅱ相代谢反应；使淫羊藿苷、朝藿定A和朝藿定C发生脱葡萄糖残基的肠菌代谢反应；使三七中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和续断中川续断皂苷VI发生羟基化I相代谢及脱糖基的肠菌代谢反应，且上述代谢产物与现有人或大鼠或体外代谢产物具一致性。上述研究提示斑马鱼与现有代谢模型具有良好的相关性[14-17]。目前，斑马鱼已成为一种被认可的、较成熟的在体代谢模型用于量微成分代谢研究[18]。2.2斑马鱼代谢模型的优势斑马鱼最大限度地保留哺乳动物代谢的系统性，能体现在体I相、Ⅱ相、肠菌及多途径代谢的综合结果，适于单体化合物及其组合物等代谢研究。该模型突破了量微成分难以进行在体代谢的瓶颈，具简单、高效、低成本、化合物用量少（μg～mg）的优势，益于代谢产物的简单、高效富集。
3二维斑马鱼模型联合色谱技术筛选中药抗骨质疏松活性成分的思路与方法
3.1二维斑马鱼模型与现代色谱联用的联合思路与方法提出二维斑马鱼模型在这里指斑马鱼骨质疏松模型和斑马鱼代谢模型：斑马鱼骨质疏松模型可用于量微成分（药物质量浓度μg・L-1～mg・L-1）抗骨质疏松活性的在体高效筛选。斑马鱼代谢模型可模拟体内I相、Ⅱ相、肠菌代谢及多途径代谢综合结果，突破量微成分难以进行在体代谢的瓶颈，用于代谢产物的高效富集以供生物活性评价。
现代色谱联用技术：现代色谱特别是多种色谱组合、多维色谱及其联用技术具强大的化合物富集、分离、分析功能，通过不同柱填料组合、检测器组合及与多种质谱或NMR联用，可有效用于从无机到有机、从极性到非极性、从小分子到大分子复杂体系的全成分的分离分析。易于实现中药复杂成分及其代谢物的定向捕获或敲除，收集到的成分（群）足够斑马鱼骨质疏松模型的活性筛选。
综上，可将二维斑马鱼模型与现代色谱联用技术有机联合，有望使中药成分特别是量微成分与代谢物的富集、分离、分析及在体抗骨质疏松活性筛选一体化。
用该思路方法，采用斑马鱼代谢模型对1mg淫羊藿苷进行代谢，代谢液用LC-MS分析、HPLC捕获代谢产物宝藿苷I（图2），用斑马鱼骨质疏松模型评价活性，结果表明淫羊藿苷和宝藿苷I均能防止泼尼松龙诱导斑马鱼骨质疏松，且代谢物宝藿苷I的活性优于淫羊藿苷（图3，4）。提示该方法使量微成分及其代谢物的富集、分离分析、活性评价一体化，该思路方法具可行性。
3.2二维斑马鱼模型联合现代色谱联用筛选中药抗骨质疏松活性成分的方法拟选择传统补肝肾、强筋骨中药为代表（如淫羊藿、续断等），采用斑马鱼代谢模型辅助代谢产物富集，以现代色谱及其联用技术分离、捕获、敲除或鉴定原形及代谢成分（群），采用斑马鱼骨质疏松模型，以骨矿化量为指标评价活性，以实现兼顾原形及代谢产物的中药抗骨质疏松活性成分（群）的系统、高效筛选（技术路线见图5）。另选择代表活性成分及其代谢物的大鼠或细胞模型结果与斑马鱼模型结果进行对比、验证，以深入验证斑马鱼模型的合理性。
4讨论与展望
药物在体内代谢转化产生效应或毒性，有效物质包括原形成分和代谢产物，故在药效筛选过程中有必要兼顾体内外成分。目前，抗骨质疏松药物筛选主要存在2个瓶颈：药效评价模型和化合物数量（含代谢物），现有体、内外模型难以进行量微成分及其代谢物的在体抗骨质疏松活性评价。
作者前期提出并建立了斑马鱼骨质疏松模型，实现量微成分抗骨质疏松高效评价[10-12]；建立的斑马鱼代谢模型可简单、高效富集代谢产物[15-17]，且现代色谱及联用技术可高效分离、分析及定向捕获成分（含代谢物）。故三者有机联合可同时突破评价模型和化合物数量制约，实现兼顾原形成分及代谢产物的抗骨质疏松药物高效筛选。
以淫羊藿为代表，将该思路与方法用于高效筛选淫羊藿抗骨质疏松体内外活性成分（群）。该方法使中药成分特别是量微成分与代谢产物的富集、分离分析、在体抗骨质疏松活性筛选一体化，简单、高效，充分体现中药药效物质含原形成分及代谢产物，具“多成分，多靶点，整体作用”特点，为基于整体观的中药抗骨质疏松活性成分早期、快速发现提供新思路与新方法。
[参考文献]
[9]李振华，DeepaAlex，徐燕玲，等.斑马鱼：新型骨骼研究模式生物[J].中药药理与临床，2010，26（3）：67.
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[11]王长梅，韦英杰，贾晓斌，等.波尼松龙诱导斑马鱼骨质疏松模型的建立[J].世界科学技术――中医药现代化，2013，15（3）：509.
[12]韦英杰，王长梅，詹扬，等.基于模式生物斑马鱼创立中药壮骨效应评价新模型的思路与方法[J].世界科学技术――中医药现代化，2013，15（2）：196.
[13]陈秋霞，曾苏.斑马鱼在药物代谢中的研究进展[J].药学学报，2011，46：1026.
[17]韦英杰，薛小露，刘炜，等.模式生物斑马鱼对川续断皂苷VI的代谢研究[J].药学学报，2013，48（2）：281.