核心期刊投稿运用代谢组学技术研究发现炮制引起大黄多成分变化
发布时间：2014-06-11 14:55所属分类：临床医学论文浏览：1次加入收藏
中药大黄是最常用药材之一，中医临床常用炮制品入药，以熟大黄居多。熟大黄为大黄的干燥根及根茎以酒蒸或酒炖法炮制而成，其泻下力缓，泻火解毒[1]。熟大黄炮制过程本质上为加热过程，炮制后化学成分可能会发生部分成分的热降解或其他变化，从而导致药性药效
中药大黄是最常用药材之一，中医临床常用炮制品入药，以熟大黄居多。熟大黄为大黄的干燥根及根茎以酒蒸或酒炖法炮制而成，其泻下力缓，泻火解毒[1]。熟大黄炮制过程本质上为加热过程，炮制后化学成分可能会发生部分成分的热降解或其他变化，从而导致药性药效的变化。
[摘要]利用代谢组学技术，对大黄全成分进行对比分析，研究生熟大黄各类化学成分的变化。应用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱（UHPLC-Q-TOF）联用技术，获取大黄生品和熟品的色谱和质谱信息，采用多元统计分析技术对提取的324个特征峰进行比较分析。炮制大黄非靶向代谢组学研究中，发现大黄生品和熟品化学成分明显不同，与生大黄相比，炮制后有127个成分发生显著变化，其中125个成分含量降低，2个成分升高。该研究鉴定了其中的10个化合物，另外推测了其他23个成分的结构类型，其中15个为鞣质类，8个为蒽醌类，炮制均使它们含量降低。炮制大黄靶向代谢组学研究发现炮制使芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚含量降低。炮制显著影响大黄中多种成分的含量，代谢组学研究能够比较全面地揭示这种变化。
[关键词]核心期刊投稿,超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱,大黄,代谢组学,炮制
生、熟大黄化学成分的变化与功用的相关性研究具有重要的科学意义。目前报道[2-7]均未有从整体角度出发对大黄炮制前后化学成分进行整体研究。本文运用以生、熟大黄样本整体为分析目标的代谢组学方法，不局限于研究常见的几种化合物的变化，因为它们未必是大黄生熟异用的物质基础，而是对炮制前后大黄进行全谱数据分析，从大黄化学成分中找寻受炮制影响显著的化学成分。
1材料
Agilent1290Infinity-6520Q-TOFLC-MSSystem。色谱纯甲醇为天津市科密欧化学试剂有限公司产品，色谱纯乙腈为SpectrumChemicalMfg.Corp.产品，色谱纯醋酸为天津市科密欧化学试剂有限公司产品，水为Milli-Q超纯水。
生、熟大黄均由成都中医药大学提供，经成都中医药大学胡昌江教授鉴定为药用大黄RheumofficinaleBaill.的干燥根茎，生大黄产地为四川，熟大黄120℃高压蒸制3h，每100g大黄加30mL黄酒。
2方法
2.1样品溶液的制备
本实验以同一产地不同批次大黄生品和熟品为研究对象（7个批次），精密称取各个批次生大黄和熟大黄干燥粉末各1.00g，每份药材粉末加入50%甲醇10mL，浸泡16h后样品超声提取30min，3000r・min-1离心5min，上清液过0.22μm滤膜，待UHPLC-Q-TOF分析。
2.2超高效液相色谱-质谱联用分析条件
生、熟大黄全谱分析采用Agilent1290超高效液相色谱系统串联6520Q-TOF-MS。实验采用Agilent公司ZORBAXEclipsePlusC18色谱柱（3.0mm×150mm，1.8μm），流动相0.1%醋酸（A）-乙腈（B），梯度洗脱，0～15min，5%～100%B，流速0.4mL・min-1，柱温40℃，进样量1μL，检测波长280nm。质谱采用ESI离子源，负离子模式下采集数据，数据采集范围m/z100～1500，温度350℃，干燥器流速8L・min-1，雾化气压力275.86kPa，毛细管电压3500V，Fragmentor电压200V，skimmer电压65V。
2.3数据处理
获取UHPLC-MS指纹图谱后，采用软件XCMS进行特征峰提取，最终得到一个保留时间、质荷比和峰强度的三维数据矩阵。把数据矩阵导入软件MetaboAnalyst2.0（http：//www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/Home.jsp）中，采用主成分分析（PCA）得分图直观的表示炮制前后组间差异；通过偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）的VIP值筛选炮制前后变化显著的化学标志物；找到的化学标志物通过Metlin代谢组学数据库（http：//metlin.scripps.edu/index.php）鉴定。
2.4化合物的鉴定
本实验通过一级质谱确定精确相对分子质量，二级质谱获得断裂信息，结合Metlin搜索及已报道文献来推测化合物。
3结果与讨论
3.1数据的获取与处理
代谢组学通过比较对照组和实验组的代谢组（metabolomes，某一生物的所有代谢物组分）以寻找代谢谱的差异。代谢组学得到的是大量、多维的信息，为确保质谱信息的质量，本研究进行了样品提取和质谱分析的优化，获得了高重复性的数据。为降低系统引起的误差，使用了多样品的等量混合液作为参比溶液，然后每个样品的质谱信息与该参比溶液的质谱信息进行归一化处理。随后，应用一系列的化学计量学方法对数据进行分析，通过模式识别技术判断大黄炮制前后的变化，深入分析了炮制后大黄中各成分的变化趋势，并对炮制后变化显著的化学成分进行鉴定或结构类型的推测。
大黄所含化学成分复杂，主要包括蒽醌、鞣质及其苷类等多种成分，因此建立一种快速、高通量的分析方法是十分必要的。本研究采用安捷伦ZORBAXEclipsePlusC18（3.0mm×150mm，1.8μm）色谱柱，乙腈-0.1%醋酸溶液体系梯度洗脱，建立了快速的UHPLC同时检测多种类成分，在15min内实现了对大黄样品的全谱分析（图1）。
对图1进行直观分析，可以看出生大黄和熟大黄在化合物含量（量）和组成（质）上都有差别，与生大黄相比，熟大黄的绝大部分主成分含量明显下降。因此对其进行多元统计分析，以更加系统、准确和客观地在大黄中找到受炮制影响显著的化学成分。UHPLC-MS原始数据不能直接用于后续的数据分析，必须经过峰判别、峰对齐和归一化等前处理步骤。本文采用XCMS软件对样本进行特征峰提取，最终提取了包含756个特征峰的三维矩阵（峰序列号、样本号、峰强度），经t检验发现其中有543个特征峰具有统计学意义（P