《中国当代医药》投稿论文范文下载参考
发布时间：2014-07-07 15:08所属分类：临床医学论文浏览：1次加入收藏
醒脑通络注射液是由江苏康缘药业股份有限公司研发的中药注射剂，处方由水牛角、地黄、黄芩、三七、赤芍、人工麝香共6味组成，临床上用于治疗脑出血性中风[1]。本研究参照《中国药典》2010年版一部附录[2]的要求及文献[3-10]采用AccQ Tag柱前衍生法建立了成品
醒脑通络注射液是由江苏康缘药业股份有限公司研发的中药注射剂，处方由水牛角、地黄、黄芩、三七、赤芍、人工麝香共6味组成，临床上用于治疗脑出血性中风[1]。本研究参照《中国药典》2010年版一部附录[2]的要求及文献[3-10]采用AccQ Tag柱前衍生法建立了成品中的氨基酸指纹图谱，并对各氨基酸进行了定量研究，建立了较全面的氨基酸质量控制方法，以更为有效快捷的控制醒脑通络注射液的内在质量。
[摘要] 目的：采用定量指纹图谱对醒脑通络注射液成品中的氨基酸成分进行控制，以此来评价其产品的质量。方法：采用AccQ Tag柱前衍生的方法，建立醒脑通络注射液中氨基酸成分的定量指纹图谱方法，对10批醒脑通络注射液中的各氨基酸进行定量检测，并结合10批成品的相似度指标，综合评价其质量。结果：醒脑通络注射液中含有12种氨基酸，各氨基酸特征峰定量结果均一、稳定，10批成品指纹图谱相似度在0.90以上。结论：该方法准确、可行，是一种简便、有效的中药质量评价手段。
[关键词] 《中国当代医药》,醒脑通络注射液,定量指纹图谱,AccQ Tag柱前衍生,氨基酸
1 材料与方法
1.1 材料
Waters2695-2487高效液相色谱仪(美国沃特斯特公司)，电热恒温鼓风干燥箱(上海新苗公司)，快速涡旋混合器(美国安胜科技有限公司)。 AccQ Tag 氨基酸测定试剂盒(包括AccQ Flour氨基酸专利衍生剂、专用氨基酸分析柱、玻璃样品衍生管)、17种混合氨基酸标准液(浓度均为2.5 mol・mL-1) 美国Waters 公司;乙腈(色谱纯)。水 (超纯水 );其余试剂均为分析纯。醒脑通络注射液来自江苏康缘药业股份有限公司。
1.2 色谱条件
AccQ Tag色谱柱(3.9 mm×150 mm， 5 μm)柱;柱温37 ℃;流动相A：按1∶10将AccQ TagA浓液用水稀释，流动相B：乙腈，C：高纯水，梯度洗脱程序见表1。流速1 mL・min-1;检测波长248 nm;进样量10 μL，理论板数按苏氨酸峰计算应不得低于4 000。
1.3 对照品溶液的制备
用移液器移取17种氨基酸的标样100 μL，加0.90 mL水稀释，混匀，备用。该标准溶液的氨基酸浓度为0.25 mol・L-1。精确吸取10 μL于衍生用小管中(6 μm×50 mm)，加入70 μL 硼酸盐缓冲液，涡旋混合后，在涡旋状态下加入20 μL 刚配好的AccQ Fluor 衍生剂，保持涡旋混合15 s。室温放置l min 后用石蜡膜封口，于50 ℃烘箱内加热10 min，取出冷至室温，即得。
1.4 供试品溶液的制备
精密吸取醒脑通络注射液1 mL，置10 mL量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
1.5 空白溶液的制备
以纯化水作为空白溶液。
1.6 衍生方法
①将烘箱开启并恒温至55 ℃;②用清洁的移液管分别取参照物溶液、供试品溶液及空白溶液各10 μL，分别注入6 μm×50 mm的衍生管底部;③换一清洁移液管头，加AccQ Fluor硼酸盐缓冲液70 μL至衍生管中，涡旋混合;④另换一清洁移液管头吸取20 μL刚刚配好的AccQ Fluor衍生剂，在涡旋状态下加到衍生管中，并保持涡旋混合10～15 s;⑤在室温下放置1 min;⑥将衍生管用封口膜封口，放在55 ℃烘箱内加热10 min，取出移入100 μL的进样管，即得。
分别精密吸取衍生后的参照物溶液、供试品溶液及空白溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定。
2 结果与分析
2.1 指纹图谱方法验证与检验
2.1.1 指纹图谱方法学考察 比较各批号醒脑通络注射液样品的指纹图谱，含有13个共有色谱峰，各峰分离度良好，分离度在规定范围内，见图1。
1.丝氨酸;2.谷氨酸;3.甘氨酸;4.精氨酸;5.苏氨酸(S);6.丙氨酸;7.脯氨酸;8.缬氨酸;9.赖氨酸;10.异亮氨酸;11.亮氨酸;12.苯丙氨酸。
图1 醒脑通络注射液指纹图谱
Fig.1 Fingerprint of Xingnao Tongluo injection
精密度试验：取批号为100301的醒脑通络注射液，按上述供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，连续进样6次进行测定。以第1次进样所得指纹图谱做为对照计算后5次进样所得指纹图谱的相似度，结果相似度均不小于0.98，均符合指纹图谱的技术要求，表明该方法精密度良好。
稳定性试验：取批号为100301的醒脑通络注射液，按上述供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，于0，1，3，6，9，12 h分别测定1次指纹图谱，共测6次，以0 h进样所得指纹图谱为对照计算相似度，相似度结果均不小于0.98，表明供试品溶液12 h内成分是稳定的，符合指纹图谱的技术要求(应不小于0.95)。
重复性试验：取批号为100301的醒脑通络注射液，按上述供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，同法制备供试品溶液6份，依法测定，结果计算相似度，相似度结果均不小于0.99，符合指纹图谱的技术要求(不小于0.95)。 根据以上方法学考察结果，表明该方法测定醒脑通络注射液的氨基酸指纹图谱精密度、重复性、稳定性均较好，能够准确测定该制剂的氨基酸指纹图谱。
指纹图谱相关性研究：分别取醒脑通络注射液、水牛角提取物、三七提取物、黄芩提取物、麝香蒸馏液、丙二醇适量，按供试品的制备方法制备，分别测定。取水牛角药材适量，以2.5 mol・L-1的硫酸溶液水解完全，以氢氧化钠溶液中和后，按供试品的制备方法制备，测定。药材及各中间体相关性见图2。
A.水牛角提取物;B.醒脑通络注射液;C.水牛角药材;D.三七提取物;E.黄芩提取物;F.麝香蒸馏液;G.丙二醇。
图2 制剂与药材、中间体指纹图谱相关性
Fig.2 The relations between and among Xingnao Tongluo injection， medicinal materials and intermediates
由相关性图谱可见，指纹图谱中的9号峰主要来源于黄芩提取物及丙二醇。12种氨基酸主要来源于水牛角，三七提取物也存在一定的量。
指纹图谱的建立：分别取10批不同批号的醒脑通络注射液，按供试品的制备方法制备，分别测定。将 10批醒脑通络注射液指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统的操作规范软件(版本2004A)， 对保留时间 13～38 min(溶剂峰剪切：0～13 min，38～45 min)的色谱峰进行多点校正后，自动匹配，生成对照指纹图谱，见图1，3，共标定13 个共有峰， 其中苏氨酸为参照峰(S)，各批醒脑通络注射液样品与对照指纹图谱比较相似度在 0.982～0.993，具体数据见表2。
图3 10批醒脑通络注射液指纹图谱
Fig.3 Fingerprint of ten batch Xingnao Tongluo injection
2.2 含量测定方法验证与检验
2.2.1 阴性供试品制备 取黄芩提取物、麝香蒸馏液、丙二醇按照制备工艺制备，制备阴性供试品溶液，测定，阴性结果见图4。
2.2.2 含量测定方法学考察 标准曲线及线性范围：精密取12种氨基酸标样(2.5 mol・mL-1)0.2，0.4，0.6，0.8，2.0，3.0 mL加高纯水至10 mL稀释，分别取10 μL按照1.6项衍生条件衍生，注入液相色谱仪，测定。分别记录峰面积A。以峰面积对相
1.丝氨酸;2.谷氨酸;3.甘氨酸;4.精氨酸;5.苏氨酸;6.丙氨酸;7.脯氨酸;8.缬氨酸;9.赖氨酸;10.异亮氨酸;11.亮氨酸;12.苯丙氨酸。
图4 12种混合氨基酸标准液(A)、醒脑通络注射液(B)、阴性供试品(C)的HPLC图
Fig.4 HPLC Chromatograms of 12 amino acids(A)， Xingnao Tongluo injection(B) and blank reference(C)
应摩尔浓度进行回归，各组分的线性回归方程及相关系数见表3。
精密度试验：以2.2.1项中线性的第3个点对照品溶液为考察点，精密吸取衍生后的对照品溶液10 μL进样测试，记录峰面积A，连续进样6次，测得6次的RSD分别为1.38%(丝氨酸，Ser)，1.1%(谷氨酸，Glu)，1.1%(甘氨酸，Gly)，0.91%(精氨酸，Arg)，0.69%(苏氨酸，Thr)，0.83%(丙氨酸，Ala)，0.78%(脯氨酸，Pro)，0.89% (缬氨酸，Val)，0.79%(赖氨酸，Lys)0.98%(异亮氨酸，Ile)，0.91%(亮氨酸，Leu)，0.85%(苯丙氨酸，Phe)，结果表明，仪器精密度良好。
稳定性试验：分别在0，2，4，6，8，10，12 h，精密吸取衍生后的供试品溶液10 μL进样测试，记录峰面积A，分别测得RSD为2.2%(Ser)，2.3%(Glu)，2.5%(Gly)，2.3%(Arg)，2.8% (Thr)，2.8%(Ala)，2.0%(Pro)，1.3%(Val)，2.6%(Lys)，2.0%(Ile)，2.2%(Leu)，2.6% (Phe)，结果表明，供试品溶液在12 h内稳定性良好。
重复性试验：平行制备供试品溶液6份，分别精密吸取衍生后的供试品溶液10 μL进样测试，记录峰面积A，分别测得RSD为2.8%(Ser)，2.7%(Glu)，2.5%(Gly)，2.7%(Arg)，2.2% (Thr)，2.5%(Ala)，2.7%(Pro)，2.3%(Val)，2.5%(Lys)，2.9%(Ile)，2.1%(Leu)，2.7% (Phe)，结果表明，供试品溶液的重复性符合规定。
加样回收率试验：取已知含量的醒脑通络注射液(批号 20100301，Ser，Glu，Gly，Arg，Thr，Ala，Pro，Val，Lys，Ile，Leu，Phe的质量分数分别为 0.17，0.07，0.13，0.43，0.20，0.20，0.35，0.29，0.13，0.16，0.33，0.15 g・L-1)进行加样回收率试验。具体方法如下：精密吸取本品0.5 mL，置10 mL量瓶中，精密加入12种氨基酸的溶液(精密吸取氨基酸标样溶液1 mL，置10 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得(Ser，Glu，Gly，Arg，Thr，Ala，Pro，Val，Lys，Ile，Leu，Phe的质量分数分别为0.26，0.37，0.19，0.44，0.30，0.22，0.29，0.29，0.37，0.33，0.33，0.41 g・L-1)0.5 mL，加水定容至刻度，摇匀，平行制备6份，按照1.6项衍生方法衍生后进行测定，计算回收率。结果回收率分别为 96.3%，95.4%，97.2%，98.5%，101%，101%，98.5%，103%，101%，99.4%，101%，104%，RSD分别为 2.8%，2.5%，3.1%，2.1%，1.6%，1.1%，2.4%，3.0%，2.1%，1.9%，1.5%，2.8%，结果表明回收率较好。 样品测定：分别取10批不同批次的醒脑通络注射液，依法分别测定，计算12种氨基酸的含量测定数据，结果见表4。
3 讨论
醒脑通络注射液处方中水牛角经酸水解，故测定氨基酸时无需对样品进行水解处理。氨基酸为末端吸收，因此要衍生化完全才能准确检测。本法中氨基酸衍生试剂在紫外图谱中可产生吸收，因此，通过对比观察剩余氨基酸衍生试剂的量，可以较为方便的得知氨基酸衍生化的程度。
本方法衍生过程中加热的目的是将衍生酪氨酸时的副产物转化为单一的主产物。在室温下此转化反应较缓慢，其半衰期约1 h，衍生空白溶液时无需加热。
醒脑通络注射液定量指纹图谱方法学考察结果表明，该方法精密度、重复性、回收率结果均较好，能够准确、快速的测定醒脑通络注射液氨基酸指纹图谱及12中氨基酸的具体含量。且该方法重复性良好，10批醒脑通络注射液的指纹图谱相似度均在0.95以上，12种氨基酸的含量均一、稳定。该方法从定性及定量2个层面反应醒脑通络注射液中氨基酸的存在情况，提高了醒脑通络注射液氨基酸质量评价水平。
[参考文献]
[1] 孙兰，李家春，李芳，等. 惊天宁注射液在大鼠体内药代动力学研究[J]. 中药药理与临床， 2011，27 (4) ：80.
[2] 中国药典.一部[S]. 2010.
[3] 高向阳，刘娜. AccQ・Tag柱前衍生反相-高效液相色谱法测定齿果酸模中的氨基酸含量[J]. 食品科学，2011，32(20)：160.
[4] 师涛，吕琳昂，覃峰，等. 定量指纹图谱在安神补脑液质量评价中的应用[J].中国药学杂志， 2009，44 (5) ：386.
[5] 郑灏，程显隆，魏锋，等. 雷丸中 16 种氨基酸的柱前衍生化RP-HPLC法含量测定[J].药物分析杂志， 2011，31 (9) ：1631.
[6] 毕宇安，王振中，宋爱华，等. 热毒宁注射液高效液相色谱指纹图谱研究及多成分定量分析[J] . 世界科学技术， 2010，12 (2) ：298.
[7] 邹秦文，肖新月，程显龙，等. 百令胶囊中17种氨基酸的柱前衍生化RP-HPLC法含量测定[J] . 药物分析杂志， 2010，30 (9) ：1630.
[8] 杨菁，孙黎光，白秀珍， 等. 异硫氰酸苯酯柱前衍生化反相高效液相色谱法同时测定 18 种氨基酸[J]. 色谱， 2002， 20(4)： 369.