中药论文范文蒸制三七中的10种人参皂苷类活性成分的含量
发布时间：2014-06-11 15:03所属分类：临床医学论文浏览：1次加入收藏
三七为五加科植物三七Panaxnotoginseng（Burk.）F.H.Chen的干燥根，主产于云南、广西等地。《本草纲目拾遗》记载：人参补气第一，三七补血第一，味同而功亦等，为我国名贵中药。据中国传统古籍记载，三七生品具有止血、散瘀、消肿、止痛等功效[1]；炮制品具
三七为五加科植物三七Panaxnotoginseng（Burk.）F.H.Chen的干燥根，主产于云南、广西等地。《本草纲目拾遗》记载：“人参补气第一，三七补血第一，味同而功亦等”，为我国名贵中药。据中国传统古籍记载，三七生品具有止血、散瘀、消肿、止痛等功效[1]；炮制品具有补血、增强免疫功能、抑制肿瘤、强壮、生肌等功效[1-2]。熟三七的传统炮制方法有蒸制、油炸、熏制、黑豆汁蒸制等[3]，由于社会经济的发展以及炮制加工条件的改变，现代采用最常用、便捷的炮制方法为蒸制，本文中的熟三七即指蒸制三七。
[摘要]该文建立了蒸制三七中人参皂苷Rg6，F4，Rk3，Rh4，20（S）-Rg3，20（R）-Rg3，Rk1，Rg5，20（S）-Rh2，20（R）-Rh210种皂苷类活性成分同时含量测定的超高效液相色谱方法，并对其不同头数、不同药用部位、不同蒸制时间的样品进行含量测定和质量控制研究。所采用的色谱条件为ACQUITYBEHC18色谱柱（2.1mm×100mm，1.7μm），流动相乙腈-水，梯度洗脱，流速0.3mL・min-1，检测波长203nm，柱温35℃。结果显示，人参皂苷Rg6，F4，Rk3，Rh4，20（S）-Rg3，20（R）-Rg3，Rk1，Rg5，20（S）-Rh2，20（R）-Rh2分别在0.46～115，2.06～515，1.632～408，3.216～804，1.392～348，1.4～350，0.496～248，3.012～1506，0.82～205，0.832～208mg・L-1具有良好的线性关系（R2≥0.9998），平均回收率分别为97.00%，97.96%，98.86%，95.27%，98.67%，98.02%，95.53%，96.63%，99.57%，103.6%。该方法快速、准确、重复性好、分离度高，可有效控制蒸制三七的质量，为制定其规范化炮制工艺和质量标准，确保其临床疗效的可靠性与一致性奠定了基础。
[关键词]中药论文范文,蒸制三七,人参皂苷,UPLC,多成分同时测定,质量控制
现代研究表明三七的主要有效成分为皂苷类化合物，代表了三七大部分生物活性。近年来研究发现，三七炮制前后成分变化差异较大。蒸制三七中含有大量的不同于生三七的皂苷类化合物[4]，据报道，从蒸制三七活性部位中分离得到的皂苷类化合物有人参皂苷Rg3，Rg6，F4，Rh4，Rk3，Rg5，Rk1，Rh2等[5-6]。药理试验表明以人参皂苷Rg3，Rg6，F4，Rh4，Rk3，Rk1，Rg5等为代表的皂苷类化合物具有增强免疫功能、抑制肿瘤等多种生物活性[7-11]，多种皂苷类成分的配伍是蒸制三七发挥临床疗效的物质基础。因此考虑将其作为蒸制三七饮片含量测定的指标成分。
三七在临床上的使用同样有生熟之分，两者功用俱佳但存在显著差异，是中药炮制理论“生消熟补”的典型药[12]。但2010年版《中国药典》只收载了三七药材及其饮片三七粉，并未收录其他炮制品种。事实上，正因为《中国药典》中未收录炮制品熟三七，导致在目前国内中医临床上，生三七及其炮制品熟三七经常作为同一饮片“三七”同样使用；国外如新加坡等东南亚市场上也有多种剂型生、熟三七制品在作为补品“三七”销售。对于国外使用者甚至大部分国内使用者来说并不了解中医在遣药组方时讲究“药之生熟，生熟效异，各有其功，用法不同”。因此很可能会因无法辨识生、熟三七而混用、错用，导致不良后果[13]。
为客观地评价和控制三七炮制品，即蒸制三七的质量，笔者建立了同一UPLC色谱条件下分离、测定蒸制三七中人参皂苷Rg6，F4，Rk3，Rh4，20（S）-Rg3，20（R）-Rg3，Rk1，Rg5，20（S）-Rh2，20（R）-Rh2等10种活性成分的方法，并对不同头数、不同部位、不同蒸制时间的熟三七进行了10种成分含量变化的研究。该方法灵敏、高效、准确，可为蒸制三七饮片的质量控制提供快速准确的检测方法，并为制定熟三七质量标准提供依据。
1材料
ACQUITYUPLC（美国Waters公司，包括四元高压梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、Empower2色谱工作站），梅特勒1/10万电子天平，Millipore超滤仪。
蒸制三七，收集云南产不同头数的三七饮片和三七根须，于实验室常压蒸锅100℃蒸制不同时间后即得。人参皂苷20（S）-Rg3（纯度≥98%，批号MUST-11041211），20（R）-Rg3（纯度≥98%，批号MUST-11080811），20（S）-Rh2（纯度≥98%，批号MUST-11091602），20（R）-Rh2（纯度≥93.44%，批号MUST-12032601）均购自成都曼斯特生物科技有限公司；人参皂苷Rg6（纯度≥98%），F4（纯度≥98%），Rk3（纯度≥98%），Rh4（纯度≥98%），Rg5（纯度≥98%），人参皂苷Rk1（纯度≥95.04%）均为本实验室自制。甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯。
2方法与结果
2.1对照品溶液的制备分别精密称取人参皂苷Rg6，F4，Rk3，Rh4，20（S）-Rg3，20（R）-Rg3，Rk1，Rg5，20（S）-Rh2，20（R）-Rh2对照品1.15，5.15，4.08，8.04，3.48，3.50，2.48，15.06，2.05，2.08mg置于10mL量瓶中，加少量甲醇溶解后用甲醇定容，制得混合对照品储备液。
2.2供试品溶液的制备取不同头数蒸制三七饮片粉末1g，精密称定，置三角烧瓶中，加甲醇50mL，超声提取40min后过滤，收集滤液，置水浴锅上挥去甲醇，加甲醇溶解残渣，并定容置10mL量瓶中，摇匀，过0.45μm的微孔滤膜，取续滤液即得。2.3色谱方法ACQUITYBEHC18色谱柱（2.1mm×100mm，1.7μm）；流动相水（A）-乙腈（B），梯度洗脱，0～4min，20%～28%B；4～4.5min，28%～36%B；4.5～8min，36%～43%B；8～14min，43%～50%B；14～14.5min，50%～64%B；14.5～20min，64%～100%B。流速0.3mL・min-1；柱温35℃；检测波长203nm。色谱图见图1，2。
2.4线性关系考察取2.1项下混合对照品储备液分别稀释2，5，10，20，40，80，100，250倍，得到一系列浓度的混合对照品溶液，按2.3项下色谱条件，进样2μL。以峰面积积分（Y）对浓度（X）进行线性回归，得到10种皂苷类成分的回归方程、相关系数、线性范围、检测限和定量限，见表1。
2.5精密度试验对于日内精密度，按2.2项下制备30头三七蒸制10h供试品溶液（批号1010158），取2.1项下混合对照品储备液适量加甲醇稀释10倍的溶液，分别精密吸取2μL，以2.3项下色谱条件分别连续进样6次；对于日间精密度，连续3d同法测定，计算峰面积的相对标准偏差。结果30头三七蒸制10h供试品溶液和混合对照品溶液各指标成分日内、日间精密度的RSD均小于3%，表明精密度良好。
2.6重复性试验取同一批30头三七蒸制10h样品（批号1010158），精密称定，分别制备6份供试品溶液，按2.3项下色谱条件进样2μL，计算峰面积的相对标准偏差。结果显示，供试品溶液各指标成分的RSD均小于4%，表明重复性较好。
2.7稳定性试验精密吸取同一批30头三七蒸制10h供试品溶液2μL，分别于配制后0，1，2，3，6h时进样，考察其稳定性，计算峰面积的相对标准偏差，供试品溶液各指标成分的RSD均小于3.5%，表明供试品溶液在6h内各成分均稳定。
2.8加样回收率试验取同一批号（批号1010158）已知30头三七蒸制10h供试品6份，分别精密加入等同于样品含量的10种人参皂苷化合物对照品，按2.2项下方法制备，以2.3项下色谱条件进样2μL，人参皂苷Rg6，F4，Rk3，Rh4，20（S）-Rg3，20（R）-Rg3，Rk1，Rg5，20（S）-Rh2，20（R）-Rh2的平均回收率分别为97.00%，97.96%，98.86%，95.27%，98.67%，98.02%，95.53%，96.63%，99.57%，103.6%；RSD分别为1.7%，0.41%，0.45%，0.56%，1.7%，3.9%，0.51%，0.48%，3.5%，1.5%。
2.9样品的测定取不同头数、不同部位、蒸制不同时间后的三七饮片，按2.2项下方法和2.3项下色谱条件进行含量分析，结果见表2。
3讨论与结论
近年来对三七的蒸制研究日益增多，但文献大多以生三七为研究对象，研究蒸制时皂苷成分含量的变化、结构的转变以及蒸制后产生的部分微量次级皂苷的定性、鉴别[4-6，14]。尚未见从炮制角度出发的关于蒸制三七饮片的质量控制方面的研究报道。由于目前国内临床应用和国外药店销售三七既有生三七也有熟三七，因此以蒸制三七为研究对象，对其蒸制过程所产生的成分进行定量和质量控制研究，为制定合理的蒸制三七炮制规范和质量标准奠定基础。
近年来采用能够体现中药整体性特征的多成分含量测定法来控制中药的质量已成为共识[15]。实验中发现人参皂苷20（R/S）-Rh1是蒸制过程中显著增加的成分，但其保留时间与人参皂苷20（R/S）-Rg2，三七皂苷R2非常接近，色谱峰无法完全分开，易被干扰，因此未选择人参皂苷20（R/S）-Rh1作为蒸制三七的专属性指标成分。笔者结合相关文献选择分离度好且生三七中几乎不存在的人参皂苷Rg5，Rh4，Rk1，Rk3，20（R/S）-Rh2和生三七中少量存在，蒸制三七中大量增加的人参皂苷20（R/S）-Rg3，以及前期试验研究在蒸制三七中分离得到其特有的人参皂苷Rg6，F4这10个活性成分作为蒸制三七的专属性指标成分。以期尽可能反映的蒸制三七的内在特性并进行质量控制。
本实验比较了50%，70%，85%甲醇、甲醇等不同溶媒的提取效率及提取方法和提取时间，发现采用甲醇超声提取蒸制三七粉末40min，可较好的将偏脂溶性的皂苷类成分较完全的提取出来，方法简便、易行。本实验比较了不同长度的色谱柱，发现虽然5cm长的色谱柱平衡时间和分析时间短，但10cm长的色谱柱的分离度要好于5cm；比较了20，25，30，35，40℃等不同柱温对色谱峰分离的影响，结果显示柱温在35℃时，供试品分离度较好，分析时间适宜。由于所测皂苷类成分在低波长下有末端吸收，故选择203nm作为检测波长。选择在低波长下自身溶剂吸收干扰比较小的乙腈为流动相，并采用乙腈-水溶液二元梯度洗脱，利于多成分的分离。
笔者以不同头数、不同蒸制时间三七饮片为研究对象，通过预实验，选取上述10个活性成分为检测指标，通过同一色谱条件下的含量测定来控制蒸制三七的内在质量。结果表明，不同头数蒸制三七中10种皂苷类活性成分的含量存在差异，其中20，30，40头蒸制三七含量略大于60，80，100头，一般差异在1～2倍之间，个别指标达到2～3倍。实验结果提示三七蒸制后，原先三七不同头数之间质量较大的差异变小，说明蒸制可使不同规格的三七质量均一化，有利于蒸制三七的质量控制和体现临床疗效。另外，不同药用部位蒸制三七根须中10种皂苷类活性成分的含量与60，80，100头蒸制三七基本相同。提示三七根须蒸制后也可作为熟三七使用。在不同蒸制时间点的10种皂苷类活性成分的含量变化趋势基本一致，变化规律均表现为随着时间的延长，10种皂苷类活性成分的含量均不同程度的增加。其中人参皂苷Rg5，Rh4的含量随着时间的延长增加最多，人参皂苷20（R/S）-Rh2则增加最少，其它几种成分含量的增加相差不大，变化趋势介于前两者之间。提示10种皂苷类活性成分在蒸制过程中的含量是动态变化、整体上是不断增加的，蒸制10～12h后各活性成分的增加趋势趋于平缓。蒸制时间对三七规范化炮制有重要影响，它决定了蒸制三七的内在质量。本文采用UPLC建立了蒸制三七皂苷类多成分含量测定方法，并对不同头数、不同药用部位、不同蒸制时间的多成分指标进行了含量测定。本研究既提供了一种快速、准确、重复性好、分离度高的方法，又可为全面控制蒸制三七的质量，制定其规范化炮制工艺和质量标准，确保其临床疗效的可靠性与一致性奠定基础。本文不仅对三七蒸制品质量控制有实际意义，同时对同属植物来源中药（如人参、西洋参、竹节参等）的炮制品质量控制也有一定借鉴作用。
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